Structural studies of molecular machines involved in gene expression

Mgr. Hana Černá, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Hladina transkriptu je v eukaryotických buňkách přísně regulována takzvaným systémem kontroly kvality RNA. Tato disertační práce se zaměřuje na dva důležité členy tohoto kontrolního mechanismu v Sacharomyces cerevisie – na Trf4/5-Air1/2-Mtr4 (TRAMP) polyadenylační komplex a Nrd1–Nab3–Sen1 (Nrd1) komplex. Nrd1 komplex je nezbytný pro terminaci transkripce nekódujících RNA, které jsou produkovány RNA polymerasou II (RNAP II). Směrování Nrd1 komplexu k místu transkripce je řízeno postranslačními modifikacemi C-terminální domény (CTD) RNAPII. S pomocí NMR spektroskopie jsme vyřešili strukturu komplexu Nrd1 proteinu navázaného k fosforylované CTD (pSer5) a provedli funkční analýzu této interakce. Druhá část této práce je věnována TRAMP komplexu, který rozpoznává širokou škálu RNA, jež jsou předurčeny k degradaci či zpracování. Komplex polyadenyluje jejich 3’ konec a stimuluje jejich další zpracovávání exosomem. TRAMP komplex obsahuje Air1/2 protein, u něhož se předpokládá, že je zodpovědný za vazbu RNA. Mechanismus rozpoznávání RNA je však stále velice nejasný. Abychom prokázali, že je Air skutečně RNA vázající protein, studovali jsme centrální část Air2 proteinu s pomocí NMR spektroskopie a fluorescenční anizotropie. Vyřešili jsme jeho strukturu a ověřili jeho interakce s různými druhy RNA substrátu. Souhrnem, tato disertační práce přináší strukturně a mechanisticky jedinečný náhled na to, jak je systém kontroly kvality RNA směrován k místu transkripce a jak rozpoznává RNA substráty.

Abstract:

In eukaryotic cell, the production, maintenance and degradation of RNA molecules is strictly regulated by RNA surveillance system. This thesis is focused on two important members of this system in Sacharomyces cerevisie – Trf4/5-Air1/2-Mtr4 (TRAMP) polyadenylation complex and Nrd1–Nab3–Sen1 (Nrd1) complex. The Nrd1 complex plays a central role in transcription termination of non-conding RNAs produced by RNA polymerase II (RNAP II). Recruitment of the Nrd1 complex is controlled by post-translational modifications of the C-terminal domain (CTD) of RNAP II. Using NMR spectroscopy, we solved the structure of the complex of Ser5 phosphorylated CTD bound to Nrd1 protein and performed functional analyses of this interaction. The second part of the thesis is dedicated to the TRAMP complex, which recognizes variety of RNAs designated for degradation or further processing, polyadenylates and promotes them to the exosome. TRAMP complex contains a putative RNA binding protein Air1/2, but the RNA recognition mechanism itself is poorly understood. To prove that Air is responsible for binding or RNA, we studied the central region of Air2 by NMR spectroscopy and fluorescence anisotropy. We determined its three-dimensional structure and studied interaction of Air2 protein with different RNA substrates. Altogether, this thesis reveals unique structural and mechanistic insights of how this important RNA surveillance system is recruited to the site of transcription and binds RNA substrates.

Keywords

RNA, Nrd1 complex, TRAMP complex, transcription, RNA quality control, RNAprotein interaction, noncoding RNA, proteinprotein interaction, NMR

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 4. 10. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 30. 10. 2013
• Vedoucí: doc. Mgr. Richard Štefl, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Dalibor Blažek, Ph.D., Mgr. Hassan Hashimi, PhD.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Biomolekulární chemie