Exprese molekul dráhy Spindle Assembly Checkpoint (SAC) a funkce SAC během embryonálního vývoje savců

Bc. Regína Gomolková

Master's thesis

Expression of molecules from Spindle Assembly Checkpoint (SAC) pathway and function of SAC during early development of mammals

Abstract:

Oocyty a časná embrya vykazují vyšší riziko vzniku segregačních poruch. V důsledku nesprávné chromozomové segregace vznikají numerické chromozomové aberace tzv. aneuploidie. Aneuploidie jsou nejčastější příčinou potratů, popř. vzniku vývojových vad. Vzhledem k současnému trendu oddalování mateřství se s rostoucím věkem matky zvyšuje i riziko vzniku aneuploidních oocytů. Pro správnou segregaci chromatid/ chromozomů oocytů a z nich se vyvíjejících embryí je nezbytná kontrola buněčného cyklu. Jedním z kontrolních mechanismů buněčného cyklu je i kontrolní bod sestavení dělícího vřeténka (SAC z angl. spindle assembly checkpoint). SAC sehrává klíčovou roli při kontrole správnosti napojení chromozomů k dělícímu vřeténku a kontrole tenze mezi nimi, která vzniká pouze, pokud jsou chromozomy napojeny k opačným pólům dělícího vřeténka. Cílem této práce bylo zjistit hladinu exprese proteinů zapojených do SAC signalizace, jmenovitě: BubR1, Mad1, Mad2 a Securin. Tyto proteiny byly detekovány, jak za fyziologických podmínek, tak ovlivněné inhibitory. Pomocí imunofluorescenčních metod byla sledována lokalizace a změna exprese těchto proteinů. Dále byla provedena PCR pro kvantifikaci mRNA kódující výše zmíněné proteiny u různých stádií oocytů a embryí. Pro stanovení množství PCR produktů byla pomocí metody rekombinantní DNA připravena exogenní kontrolní mRNA. Výsledkem této práce je zjištění, že chemické inhibitory pozměňují expresi proteinů, které jsou nezbytné pro správné fungování SAC. Výsledek je velmi důležitý, jelikož mnoho prací používá pro synchronizaci buněčného cyklu právě tyto inhibitory.

Abstract:

Oocytes and early embryos have a higher risk of developing segregation disorders. Due to incorrect chromosomal segregation, numerical chromosomal aberrations of so-called aneuploidy arise. Aneuploidy is the most common cause of abortions, or development defects. Due to the current trend of delayed motherhood, the risk of aneuploid oocytes increases with increasing maternal age. Cell cycle control is essential for proper segregation of the chromatid/ chromosomes of oocytes and embryos developing from them. One of the cell cycle control mechanisms is the Spindle assembly checkpoint (SAC). SAC plays a key role in checking the correct connection of chromosomes to the spindle and the control of the tension between them, which only occurs when the chromosomes are connected to the opposite poles of the dividing spindle. The aim of this work was to determine the expression level of proteins involved in SAC signaling, namely: BubR1, Mad1, Mad2 and Securin. These proteins were detected both under physiological conditions and affected by inhibitors. The localization and change of expression of these proteins was monitored by immunostaining. Furthermore, PCR was performed to quantify mRNA encoding the above-mentioned proteins in different stages of oocytes and embryos. Exogenous control mRNA was prepared by recombinant DNA to determine the amount of PCR products. The result of this work is the finding that chemical inhibitors alter the expression of proteins that are necessary for the proper functioning of SAC. The result is very important, as many works use these inhibitors to synchronize the cell cycle.

Keywords

Kontrolní bod sestavení dělícího vřeténka (SAC), myší embryo, oocyt, dělící vřeténko, ZGA, kinetochory, fertilizace, dělení embrya, meióza, buněčný cyklus, Mad1, Mad2, BubR1, Securin, PCR, imunofluorescenční metody, metody rekombinantní DNA, Colcemid, Mg132, proTAME, Spindle assembly checkpoint (SAC), mouse embryo, oocyte, spindle, kinetochores, fertilization, cleavage of embryos, meiosis, cell cycle, immunofluorescence staining, recombinant DNA technology

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 6. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 2. 7. 2020
• Supervisor: doc. MVDr. Martin Anger, CSc.
• Reader: doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Special Biology