Protilátková odpověď proti antigenům z extraktů Eudiplozoon nipponicum a příprava sekundární protilátky anti-Carp IgM/IgD

Bc. Michaela Chmelíková

Master's thesis

The immune response to the antigenic molecules of Eudiplozoon nipponicum and preparation of secondary antibody anti-Carp IgM/IgD

Abstract:

Imunitní systém ryb je sloţen ze specifických a nespecifických sloţek buněčné a humorální imunity. Hlavní sloţkou specifické humorální imunity jsou protilátky (imunoglobuliny). Rybí imunitní systém produkuje pět typů imunoglobulinů – hlavní je ve formě tetrameru IgM a další, v menší míře zastoupené jsou IgD, IgZ, IgT a IgH. V experimentální části mé diplomové práce jsem se zaměřila na charakteristiku rybí imunitní odpovědi (Cyprinus carpio) proti Eudiplozoon nipponicum (Monogenea: Diplozoidae) hematofágním ektoparazitovi kaprovitých ryb. Exkrečně-sekreční produkty byly získány po inkubaci ţivých červů ve fosfátovém pufru pH 7.2, 50 mM a homogenát z celých červů byl připraven s vyuţitím sonikátoru. Oba typy vzorků byly přečištěny a vyuţity jako antigeny. Krevní séra získané z krve kaprů napadených parazitem E. nipponicum byly pouţity jako primární protilátky v metodách ELISA a Western blot. Po optimalizaci metody ELISA jsme dosáhli zajímavých výsledků, zatímco prostřednictvím Western blot byla detekována reakce pouze u jednoho pozitivního vzorku. Na částečné sekvence IgM/IgD získané z databází byly navrţeny primery za účelem amplifikace s vyuţitím PCR a RACE. Sestavit kompletní sekvenci se podařilo pouze u imunoglobulinu M.

Abstract:

The fish immune system consists of cellular or humoral specific and nonspecific factors. The dominant components of specific humoral immunity are antibodies (immunoglobulins); fish immune system produces five types of immunoglobulins – major is tetrameric IgM and insignificant are IgD, IgZ, IgT and IgH. The experimental part of my master thesis is focused on characterization of fish immune response (Cyprinus carpio) against Eudiplozoon nipponicum (Monogenea: Diplozoidae) – hematophagous ectoparasite of cyprinid fish. The excretory - secretory products were collected after incubation of live worms in phosphate buffer pH 7,2, 50 mM and homogenate from whole worm were prepared by using a sonicator. Both types of samples were purified and used as antigens. Blood serums were collected from carps parasitized by E. nipponicum and used as primary antibodies in ELISA and Western blot analysis. We achieved interesting results after optimization of the ELISA method, while Western blot detect reaction with only one positive sample. The primers were designed on the partial sequence IgM/IgD obtained from databases for amplification using PCR and RACE. Assemble the complete sequence managed only of immunoglobulin M.

Keywords

Imunita ryb, Cyprinus carpio, parazit, helminth, E. nipponicum, imunoglobulin, IgM/IgD, ELISA, Western blot, Fish immunity, parasite, immunoglobulin

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 4. 6. 2015
• Supervisor: RNDr. Martin Kašný, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry