Charakterizace vybraných aldehyddehydrogenas z čepenky odstálé (Physcomitrella patens) a ječmene setého (Hordeum vulgare L.)

Mgr. Jakub BĚLÍČEK

Diplomová práce

Characterization od selected aldehyde dehydrogenases from the moss (Physcomitrella patens) and barley (Hordeum vulgare L.)

Anotace:

Významnou skupinou aldehyddehydrogenas jsou tzv. sukcinyl-semialdehyddehydrogenasy, jež se zásadním způsobem podílejí na katabolismu -aminomáselné kyseliny. V rámci této diplomové práce byly charakterizovány dvě isoformy sukcinyl-semialdehyddehydrogenas z mechu čepenky odstálé (Physcomitrella patens) a isoforma přítomná v ječmeni setém (Hordeum vulgare L.). Všechny studované enzymy vykazovaly úzkou specifitu vůči substrátu sukcinyl-semialdehydu a koenzymu NAD+. Pro substrát sukcinyl-semialdehyd a koenzymy NAD+ a NADP+ byly vyřešeny kinetické parametry Vlim, KM a kcat. U všech tří isoforem byla pozorována inhibice nadbytkem substrátu sukcinyl-semialdehydu při použití koenzymu NAD+. Kromě kinetických parametrů byly enzymy studovány z hlediska vlivu pH, soli, glycerolu a koenzymů NAD(P)+ na stabilitu a sekundární strukturu proteinů. Přítomnost ligandu NAD+ u enzymů PpALDH5A a HvALDH5 měla na proteiny stabilizační účinek. U isoformy PpALDH5B překvapivě došlo k destabilizaci po vazbě ligandu NAD(P)+. Přídavek soli o koncentraci 300 mmoll-1 a výše měl u enzymů výrazně destabilizační vliv. Z hlediska kvartérní struktury vytvářejí všechny tři enzymy tetramery, jejichž aktivní místo i koenzym-vazebná doména jsou tvořeny vysoce konzervovanými residui napříč všech NAD+-dependentních sukcinyl-semialdehyddehydrogenas.

Abstract:

Succinic semialdehyde dehydrogenases (SSADH) create an important group of aldehyde dehydrogenase superfamily. These enzymes are involved in GABA-metabolism as a part of the GABA-shunt pathway. This diploma thesis is focused on characterization of two Physcomitrella and one barley SSADH isoforms. All three enzymes have shown a narrow substrate specifity to succinic semialdehyde (SSAL) and NAD+-coenzyme. Kinetic parametres (Vlim, KM and kcat) were determined for the substrate SSAL and coenzymes NAD+ and NADP+. Substrate inhibition for SSAL and coenzyme NAD+, characteristic of ALDH5, has been observed for all three isoforms. Beside to the kinetic assay, enzymes have been studied for the effect of pH, salt, glycerol and NAD(P)+ on the stability and secondary structure. The addition of NAD+ ligand have a stabilizing effect on the proteins PpALDH5A a HvALDH5. Surprisingly, the PpALDH5B isoform has been destabilized after NAD+ ligand binding. Salt with a concentration od 300 mmoll-1 or higher has a significant destabilizating effect on the enzymes. Based on the gel filtration chromatography, all free enzymes form tetrameric quartery structure. The active side and coenzyme-binding domain of ALDH5 enzymes are formed by highly conserved residues across all NAD+-dependent succinic-semialdehyde dehydrogenases.

Klíčová slova

ALDH5, metabolismus GABA, SSAL, ječmen, čepenka odstálá, SSADH

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 26. 4. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 24. 5. 2021
• Vedoucí: Mgr. Radka Končitíková, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie