Charakterizace a studium aktivního místa mutantních forem aldehyddehydrogenasy 5B z mechu Physcomitrella patens

Bc. Natálie BAHULOVÁ

Diplomová práce

Characterization and study of the active site of mutant forms of aldehyde dehydrogenase 5B from moss Physcomitrella patens

Anotace:

V mechu Physcomitrella patens (čepenka odstálá) byl doposud zjištěn výskyt 12 rodin aldehyddehydrogenas (ALDH), z nichž právě rodina ALDH5 je tvořena NAD+-dependentními sukcinát-semialdehyddehydrogenasami (SSADH) lokalizovanými v mitochondriích. SSADH hrají důležitou roli v katabolismu -aminomáselné kyseliny, neboť katalyzují přeměnu toxického sukcinát-semialdehydu (SSAL) na sukcinát. Diplomová práce je zaměřena na charakterizaci přirozeně se vyskytujícího typu (WT) a mutantních forem (R189A, R307A, S470A) PpALDH5B, dále se zabývá studiem aktivního místa a genovou expresí vybraných PpALDH genů. U studovaných enzymů byly stanoveny kinetické parametry pro substrát SSAL i oktanal. Při měření se SSAL byla u PpALDH5B-WT pozorována inhibici nadbytkem substrátu, zatímco mutantní formy vykazovaly kinetiku Michaelise a Mentenové. Dále byla u PpALDH5B-R189A a PpALDH5B-R307A pozorována široká substrátová specificita k alifatickým aldehydům, z nichž nejlepším substrátem byl oktanal. To je způsobeno změnou residua Arg v aktivním místě enzymu, které je nezbytné pro katalýzu. Strukturně proteiny vytváří homotetramery s větším zastoupením helixů, na jejichž stabilitu má pozitivní vliv přídavek NaCl o koncentraci 1 mol.l-1 či vyšší pH. U deficientních mutantních linií čepenky odstálé byla také studována genová exprese pomocí real-time PCR metody pro vybrané ALDH geny.

Abstract:

So far, 12 families of aldehyde dehydrogenase (ALDH) have been found in the moss Physcomitrella patens. The ALDH5 family consists of NAD+-dependent succinate-semialdehyde dehydrogenase (SSADH) localized in mitochondria. SSADHs play an important role in catabolism of -amino butyric acid. They catalyse the conversion of toxic succinate-semialdehyde (SSAL) to succinate. The diploma thesis is focused on characterization of wild type (WT) and mutant forms (namely R189A, R307A, and S470A) of PpALDH5B, it also deals with the study of its active site and gene expression of selected PpALDH genes. Kinetic parameters of the studied enzymes were determined for the substrate SSAL and octaldehyde. When measured with the SSAL, the inhibition by substrate was observed for PpALDH5B-WT while all the mutant forms exhibited classical Michaelis-Menten kinetics. Also a broad substrate specificity for aliphatic aldehydes was observed with PpALDH5B-R189A and PpALDH5B-R307A. Moreover, octaldehyde revealed as the best substrate. This effect is caused due to the change of Arg residue in the enzyme active site, which is necessary for catalysis. Structurally, the proteins form homotetramers with a greater abundance of helixes and the stability is positively influenced by addition of NaCl about a concentration of 1 mol.l-1 or higher pH. The expression of selected ALDH genes were studied in deficient mutant lines of P. patens by real-time PCR method.

Klíčová slova

ALDH5, GABA, SSAL, SSADH, Physcomitrella patens

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 25. 4. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Martina Kopečná, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie