Optimalizace podmínek PCR pro druhovou identifikaci listerií z potravin

Bc. Andrea Rosová

Master's thesis

PCR optimalization for species-specific identification of food-born listeria

Abstract:

Potraviny jsou znehodnocovány celou řadou mikroorganismů. Některé mohou být patogenní a způsobovat alimentární onemocnění. Příkladem jsou patogenní bakterie odolné vůči extrémním podmínkám prostředí. Tyto organismy jsou schopny přežívat v podobě biofilmů v potravinářských podnicích. V nich ulpívají na zařízeních a následně může dojít ke kontaminaci produktů. Mezi alimentární patogeny patří i L. monocytogenes. Jedná se o grampozitivní, nesporulující, tyčinkovitou bakterii, která může být původcem alimentárního onemocnění listerióza. Listerie jsou hojně rozšířeny v přírodě, v potravinách pak zejména v mléce, mase, zrajících sýrech, zelenině, rybách, vejcích a produktech určených k přímé spotřebě. L. monocytogenes přežívá v extrémních podmínkách prostředí, včetně širokého rozsahu pH (4,6-9,5) a obsahu soli (10 %). Listerie je psychrotrofní a roste v širokém teplotním rozmezí (1-45 °C). Cílem práce bylo nalezení vhodných primerů a optimalizace PCR podmínek pro spolehlivou identifikaci druhů listerií, zejména L. monocytogenes, vyskytujících se ve vzorcích potravin. V první fázi byla optimalizována PCR pro druhově specifické primery pro L. monocytogenes (LL5, LL6) a pro L. innocua (lin0464-F, lin0464-R). Tyto primery byly aplikovatelné pro podmínky naší laboratoře. V další fázi bylo zkoumáno, zda je možné použít rodově specifické primery (LIS-F, LIS-R) v multiplexu s druhově specifickými primery pro L. monocytogenes a pro L. innocua. Dále bylo zavedeno použití primerů specifických pro sérotypy 1/2a, 3a, 1/2c, 3c (lmo0737-F, lmo0737-R), sérotypy 1/2c, 3c (lmo1118-F, lmo1118-R,), sérotypy 1/2b, 3b, 4b, 4d, 4e (ORF2819-F, ORF2819-R), sérotypy 4b, 4d, 4e (ORF2110-F, ORF2110-R) pro podmínky naší laboratoře. Byl optimalizován průběh dělení specifických PCR produktů v elektroforéze. V poslední fázi byly zavedeny primery (inlC-F, inlC-R; lmo2821-F, lmo2821-R) pro určení patogenního potenciálu listerií. Nalezené primery mohou být použity pro druhovou identifikaci listerií, identifikaci sérotypů listerií a pro určení jejich patogenního potenciálu. Celkem byla DNA izolována ze 118 kmenů. Z toho 21 kmenů bylo referenčních, 97 kmenů bylo neznámých. Z celkového počtu neznámých kmenů bylo 84 kmenů identifikováno jako L. monocytogenes a vykazovaly patogenní potenciál. Tři kmeny byly identifikovány jako L. innocua. Zbývajících 8 kmenů se s použitím uvedených primerů nepodařilo identifikovat. 28 kmenů L. monocytogenes bylo identifikováno jako příslušící do fylogenetické skupiny I1, jednalo se tedy o sérotyp 1/2a nebo 3a. 21 kmenů příslušelo do fylogenetické skupiny I.2 (sérotyp 1/2c nebo 3c), 18 kmenů patřilo do skupiny II.1 (sérotyp 4b, 4d nebo 4e) a dalších 20 kmenů do skupiny II.2 (sérotyp 1/2b, 3b nebo 7). Podařilo se zavést a optimalizovat PCR metody pro identifikaci a charakterizaci listerií. Bakterie rodu Listeria byly izolovány např. z: salám Vysočina, tatarák, feferonky se sýrem naložené v oleji, mleté maso, vege burger, salát holandský, hermelínový salát. Většina izolátů měla patogenní potenciál. Výsledky poukazují na nezbytnost důsledných kontrol mikrobiologické bezpečnosti potravin.

Abstract:

Food is degraded by a variety of microorganisms. Some of them are pathogenic and cause foodborne illness. Pathogenic bacteria are resistant to extreme environmental conditions. These organisms are able to survive as a biofilms on surface in food processing plants and contaminate many products. L. monocytogenes is one of the alimentary pathogens. It is a gram-positive, non-spore-forming, rod shaped bacterium and may cause alimentary listeriosis. Listeria is abundant in nature, in food especially in milk, meat, ripened cheese, vegetables, fish, eggs and ready-to-eat food. Listeria monocytogenes survives in extreme environment conditions including a wide range of pH (4,6-9,5) and high content of salt (10 %). The bacterium is psychrotrophic growing at a wide temperature range (1-45 °C). The aim of this thesis was to find suitable primers and optimize PCR conditions for reliable identification of listeria species, especially L. monocytogenes, occurring in food samples. PCR was optimized for species-specific primers for L. monocytogenes (LL5, LL6) and for L. innocua (lin0464-F, lin0464-R). In the next phase, it was investigated whether it is possible to use genus-specific primers (LIS-F, LIS-R) in multiplex with species-specific primers for L. monocytogenes and for L. innocua. In the next phase, were used primers specific for serotypes 1/2a, 3a, 1/2c, 3c (lmo0737-F, lmo0737-R), serotypes 1/2c, 3c (lmo1118-F, lmo1118-R,), serotypes 1/2b, 3b, 4b, 4d, 4e (ORF2819-F, ORF2819-R), serotypes 4b, 4d, 4e (ORF2110-F, ORF2110-R) for the conditions of our laboratory. Furthermore, the separation condition in electrophoresis was optimized. In the last phase, primers (inlC-F, inlC-R; lmo2821-F, lmo2821-R) were introduced to determine the pathogenic potential of listeria under the conditions of our laboratory. Tested primers can be used for species identification of listeria, identification of listeria serotypes and to determine their pathogenic potential. In total, DNA was isolated from 118 strains. Of these, 21 strains were reference, 97 strains were unknown. Of the total number of unknown strains were 84 strains identified as L. monocytogenes and showed pathogenic potential. Three strains were identified as L. innocua. The rest of the strains were not identified by used primers. 28 strains of L. monocytogenes belonged to phylogenetic group I1, i.e. they were serotype 1/2a or 3a. 21 strains belonged to phylogenetic group I.2 (serotype 1/2c or 3c), 18 strains belonged to group II.1 (serotype 4b, 4d or 4e) and another 20 strains to group II.2 (serotype 1/2b, 3b) or 7). PCR methods for listeria identification and characterization have been established and optimized. Bacteria of the genus Listeria have been isolated, for example, from: Vysočina salami, tartare, hot peppers with cheese marinated in oil, minced meat, vege burger, Dutch salad, camembert salad. The most of isolates had pathogenic potential. The results point to the need for rigorous microbiological food safety controls.

Keywords

Listeria sp., taxonomické zařazení, PCR, optimalizace, potraviny

Keywords

taxonomic classification, PCR, optimalization, food, Listeria sp.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Eva Vlková, Ph.D.
• Reader: Iva Mrvíková, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme:
Food and Nutrition