Fenotypová a genotypová charakterizace multi-hostitelských druhů bifidobakterií

Bc. Kateřina Štivarová

Diplomová práce

Phenotypic and genotypic characterization of multi-host species of bifidobacteria

Anotace:

Bifidobakterie představují významnou komenzální skupinu bakterií, která v hojném počtu osidluje trávicí trakt člověka i zvířat. Většině bifidobakteriálních zástupců jsou připisovány příznivé účinky na zdraví hostitele skrze jejich probiotické vlastnosti. Druh Bifidobacterium dentium je naopak označován jako oportunní patogen v souvislosti s tvorbou zubního kazu. Kromě výskytu v ústní dutině, je také členem mikrobioty trávicího traktu. Je patrné, že bakterie rodu Bifidobacterium jsou schopny adaptace na podmínky, kterým jsou vystaveny v daném hostitelském prostředí. Tato diplomová práce se zabývala výše uvedeným multihostitelským druhem B. dentium, jehož výskyt je typický jak pro člověka, tak pro primáty. Cílem práce bylo charakterizovat vybrané kmeny druhu B. dentium pomocí fenotypových a genotypových metod. Na základě dosažených výsledků pak zhodnotit variabilitu mezi jednotlivými kmeny pocházející z lidských hostitelů (stolice dospělých jedinců a kojenců) a primátů (šimpanz, makak lví, pavián pláštíkový).Fenotypová charakterizace byla založena na zhodnocení morfologie buněk a provedení biochemických testů (F6PPK test – průkaz fruktózo-6-fosfát fosfoketolázy, katalázový test, hemolytický test, test utilizace mucinu a dalších substrátů – ANAEROtest 23). Z celkového počtu 20 kmenů dříve identifikovaných jako B. dentium bylo 19 kmenů – F6PPK pozitivních, kataláza negativních, negativních v hemolytickém testu a rovněž nedokázaly utilizovat mucin. Na druhou stranu dokázaly utilizovat celou řadu substrátů zahrnutých v ANAEROtestu 23, od glukózy, laktózy až po glykosid salicin. Díky fermentačním profilům byly zaznamenány mírné odlišnosti mezi hostiteli. Kmenově se odlišovaly zejména izoláty pocházející z kojenců a izoláty z šimpanzů, a to v případě utilizace trehalózy nebo celobiózy. Identita k druhu B. dentium byla potvrzena pomocí hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem (MALDI-TOF MS). Získáná spektra těchto kmenů byla téměř identická. Nicméně, F6PPK negativní, kataláza a mucin pozitivní, v biochemických testech se odlišující kmen 028 (hostitel dítě) byl danou metodou shledán jako nemožný identifikovat. Bylo tedy patrné, že kmen patří nejen k jinému druhu, ale zároveň se nejednalo o rod Bifidobacterium. Analýza genotypu testovaných bifidobakterií byla provedena pomocí fingerprintových metod, a to metodou náhodně amplifikované polymorfní DNA (RAPD-PCR) a repetitivních PCR sekvencí (REP-PCR). Na základě získaných profilů bylo možné kmeny rozdělit do několika skupin. Podařilo se detekovat variabilitu nejen v závislosti na hostitelích, ale i mezi jednotlivými kmeny. Finální taxonomické zařazení bylo provedeno sekvenováním genu 16S rRNA. Z výsledků metody vyplývá, že na rozdíl od kmenů lidského původu, by kmeny izolované z šimpanze a paviána pláštíkového mohly tvořit potenciální nový poddruh B. dentium.

Abstract:

Bifidobacteria represent an important commensal group of bacteria which abundantly inhabit the digestive tract of humans and animals. The majority of bifidobacteria are known to have beneficial effects on host's health through their probiotic properties. On the other hand, Bifidobacterium dentium is considered to be an opportunistic pathogen associated with the development of dental caries. Apart from occurring in the oral cavity, it is also a member of the gut microbiota. It is apparent that bacteria of the genus Bifidobacterium are capable of adapting to conditions to which they are exposed in a given host environment. This diploma thesis deals with multihost species B. dentium, whose occurrence is typical for humans and primates. The aim of this diploma thesis was to characterize selected B. dentium strains by phenotypic and genotypic methods. Based on the obtained results, the variability among individual strains derived from human hosts (faeces of adults and infants) and primates (chimpanzee, lion-tailed macaque, hamadryas baboon) was evaluated. The phenotypic characterization was tested based on the evaluation of cell morphology and biochemical tests (F6PPK test – detection of fructose-6-phosphate phosphoketolase, catalase test, haemolytic test, mucin and other substrates utilization tests – ANAEROtest 23). 19 out of 20 previously identified B. dentium strains were F6PPK positive, catalase negative, negative in the haemolytic test and also failed to utilize mucin. On the other hand, strains were able to utilize a variety of substrates included in ANAEROtest 23, ranging from glucose, lactose to glycoside salicin. The fermentation profiles showed slight differences between the hosts. The differences between strains were especially apparent in isolates from infants and isolates from chimpanzees. They differed mainly in trehalose and cellobiose. The identification of B. dentium species was confirmed and ribosomal spectra were characterized using Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). However, it was impossible to identify the F6PPK negative, catalase and mucin positive, in biochemical tests differing strain 028 (infant host) by this method. It was evident that the strain belongs to another species and even to a different genus than Bifidobacterium. The genotype analysis of the tested bifidobacteria was performed using fingerprint methods, namely Random amplified polymorphic DNA (RAPD-PCR) and Repetitive sequence-based PCR (REP-PCR). Based on the profiles obtained, it was possible to divide the strains into several groups. In addition, the variability was detected among hosts and also among individual strains. The final taxonomic classification was performed by 16S rRNA gene sequencing. The results of this method showed that, unlike strains of human origin, strains isolated from chimpanzees and hamadryas baboons could form a potential subspecies of B. dentium.

Klíčová slova

bifidobakterie, člověk, opice, dieta, genotyp, fenotyp

Keywords

bifidobacteria, human, monkey, diet, genotype, phenotype

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 23. 7. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. Ing. Věra Neužil Bunešová, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Výživa a potraviny / Výživa a potraviny