Metody detekce meziproduktů replikace a rekombinace DNA

Bc. Petr Pliska

Bachelor's thesis

Methods for the detection of DNA replication and recombination intermediates

Abstract:

Replikace je zahájena v místě replikačního počátku a při postupu replikačních proteinů vzniká struktura označovaná jako replikační vidlice. V repetitivních oblastech byly identifikovány pozice blokující postup replikační vidlice, což může v důsledku vést ke vzniku dvouřetězcových zlomů. Jedním z možných mechanismů opravy může být intrachromozomální rekombinace za vzniku extrachromozomálních kruhových molekul DNA. Neutrální/Neutrální Dvou-dimenzionální gelová elektroforéza nám umožňuje detekovat replikační počátky, místa blokující postup replikační vidlice, terminační pozice a extrachromozomální kruhovou DNA. Cílem této práce byla optimalizace metody Neutrální/Neutrální Dvou-dimenzionální gelové elektroforézy pro detekci replikačních a rekombinačních intermediátů. Dalším cílem bylo na základě výsledků ověřit hypotézu, že u rostlin Arabidopsis thaliana mutantních v komplexu CAF1 dochází k častějšímu kolapsu replikačních vidlic, což by mohlo vést k chybným opravám a ztrátě repetitivních sekvencí ve formě extrachromozomálních kruhových molekul DNA. Výsledky získané během optimalizace metody naznačovaly, že tyto intermediáty tvoří pouze malé množství celkové izolované DNA, které nebylo možné detekovat. Další postup optimalizace metody by mohl být založen především na synchronizaci rostlinné tkáně hydroxymočovinou a vystavení rostlin účinku genotoxických činidel.

Abstract:

Replication is initiated at the replication origin and the progress of the replication protein machinery creates a structure called the replication fork. Regions stalling the replication fork (replication fork barriers) were identified in the repetitive sequences, which are prone to the formation of double stranded breaks. One of the possible outcomes of repair may be intrachromosomal recombination which forms circular DNA molecules. Neutral/Neutral Two-dimensional gel electrophoresis allows us to detect the origins of replication, replication fork barriers, termination positions and extrachromosomal circular DNA molecules. The aim of this study was to optimize methods for Neutral/Neutral Two-dimensional gel electrophoresis for detection of replication and recombination intermediates. Another objective was to test the hypothesis based on previous results, which showed loss of rDNA in the Arabidopsis thaliana plants mutant in the CAF1 complex. These mutants may contain increased number of stalled and collapsed replication forks, which can lead to erroneous repair and loss of repetitive sequences in the form extrachromosomal circular DNA molecules. The results obtained during the optimization methods indicate that these intermediates are only a small quantity of total extracted DNA and could not be detected. Subsequent steps in the procedure of optimization methods should be based primarily on the synchronization of plant tissue using hydroxyurea and exposure to genotoxic agents.

Keywords

rDNA, CAF1, Arabidopsis thaliana, Neutrální/Neutrální Dvou-dimenzionální agarózová elektroforéza, eccDNA, replikační intermediáty

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 5. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 8. 2. 2012
• Supervisor: Mgr. Iva Mozgová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Applied Biochemistry / Applied Biochemistry