Metabolomické nástroje v diagnostice dědičných metabolických poruch

Mgr. Lukáš NAJDEKR

Disertační práce

Abstract:

Enzymy jsou biologické katalyzátory schopné přeměňovat substrát na produkt s vysokou efektivitou. Tato skupina se skládá převážně z proteinů (výjimkou je několik katalyticky aktivních RNA) a ovlivňuje nespočet substrátů (aminokyseliny, cukry, organické kyseliny, mastné kyseliny, komplexní lipidy, puriny, porfyriny atd.). V lidském genomu existuje více než 5000 genů kódujících enzymy, a proto existují stovky defektů lidských enzymů tzv. enzymopatie. Tato práce se věnuje studiu nových metabolomických přístupů v diagnostice dědičných metabolických poruch, které tvoří podstatnou část těchto enzymopatií. Deficit acyl-CoA dehydrogenázy mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem (MCADD) je defekt v beta-oxidaci mastných kyselin. V první části je uvedeno použití kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) na bázi necílené metabolomiky a cílené "flow-injection" analýzý za pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie (FIA-TMS), které vedly k objevení sloučenin produkované oxidačním stresem. Suché krevní skvrny kontrol (n = 25) a pacientů (n = 25) byly extrahovány směsi methanol / voda (1/1, v / v), a supernatanty byly analyzovány metodou LC-MS s detekcí na Orbitrap Elite MS. Data byla zpracována v XCMS a CAMERA a následně pomocí statistických metod redukujících dimenze. V PCA analýze byli pacienti jasně odlišení od kontrol. S-plot odvozený od OPLS-DA odhalil, že oktanoyl, decenoyl a dekanoyl karnitiny, jakož i tři fosfatidylcholiny (PC (16: 0,9: 0 (COOH)), PC (18: 0,5: 0 (COOH)) a PC (16: 0,8: 0 (COOH)) byly nejvíce ovlivňují metabolity. Pro ověření biologické validity těchto fosfatidylcholinů byla analyzována druhá skupina jednotlivců (pacienti (n = 25) a kontroly (n = 250). Vzorky byly měřeny pomocí modifikované metody novorozeneckého screeningu s použitím FIA-TMS (API 4000, AB Sciex) v režimu MRM. Vypočítané p-hodnota (nemám rád p-value) pro PC(16: 0,9: 0 (COOH)), PC (18: 0,5: 0 (COOH)) a PC (16: 0,8: 0 (COOH)) byly 1,927 x 10-14, 2,391 x 10-15 a 3,354 x 10-15, postupně. V další části je popisován nový způsob pro identifikaci nových potenciálních biomarkerů. Deficit adenosin deaminázy (ADA), patří do různých skupiny dědičných poruch metabolismu purinů. Tato onemocnění projevují velké množství neurologických, imunologických, hematologických a renálních projevů. Byl použit nový přístup spektrálních stromů (www.mzcloud.org), který používá k identifikaci různých metabolických modifikací vícestupňovou fragmentaci. Tento přístup nám umožňuje pomocí MSn a tzv. "zdola-nahoru" strategii zjistit jednotlivé metabolické modifikace a získat tak kompletní strukturu molekuly. Data byla naměřena za použití cíleného metabolomického přístupu pomocí UHPLC-MS Orbitrap Elite. Údaje byly vyhodnoceny softwarem Compound Discoverer 1.0.0.692 (Thermo Fisher Scientific, USA). Počet potenciálních metabolitů adenosinu a deoxyadenosinu zjištěných Compound Discovererem byl 23 (12 jedinečných hodnoty m/z). Tři struktury metabolitů byly určeny na Level 1 MSI. Zároveň byla také dokázána důležitost multistupňové fragmentace MSn. V budoucnu by tato metoda mohla představovat významný nástroj pro identifikaci metabolitů nebo malých molekul s diagnostickým potenciálem. Cílem třetí části této práce bylo popsat vliv rozlišovací schopnosti hmotnostního spektrometru u metabolomických experimentů. In silico výpočty založené na seznamu látek složeného z databází (HMDB, KEGG, LipidMaps) vycházely 15 722 unikátních hmot bez isobarů. Počet rozlišitelných hmot byl vypočten pro rozlišení až 3840k. Vzorky lidské plazmy byly analyzovány za použití UHPLC-MS Orbitrap Elite v rozlišení až 480k. V In silico výpočtech se počet rozlišitelných hmot přestal zvyšovat při rozlišení 240k. Re

Abstract:

Enzymes are biological catalysts capable of substrate conversion into a product with high efficiency. The group is mainly consisted of proteins (exceptions are few catalytic RNA) and it is influencing a vast number of substrates (amino acids, sugars, organic acids, fatty acids, complex lipids, purines, porphyrins, etc.). In human genome, there are over 5000 genes coding enzymes, therefore there are hundreds of human enzyme defects enzymopathies. This work is dedicated to study new metabolomic approaches for diagnosing inborn errors of metabolism which forms a major part of these enzymopathies. Medium chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MCADD) is a defect in -oxidation of fatty acids. In the first part it is reported the use of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) based untargeted metabolomics and targeted flow injection analysis-tandem mass spectrometry (FIA-TMS) that lead to discovery of novel compounds of oxidative stress. Dry blood spots of controls (n=25) and patients (n=25) were extracted by methanol/water (1/1, v/v) and these supernatants were analysed by LC-MS method with detection by an Orbitrap Elite MS. Data were processed by XCMS and CAMERA followed by dimension reduction methods. Patients were clearly distinguished from controls in PCA. S-plot derived from OPLS-DA indicated that octanoyl, decenoyl and decanoyl carnitines as well as three phosphatidylcholines (PC(16:0,9:0(COOH)), PC(18:0,5:0(COOH)) and PC(16:0,8:0(COOH)) were the most influencing metabolites. To biologically validate these phosphatidylcholines a second cohort of individuals were analysed (patient (n=25) and control (n=250) samples). These were measured by a modified newborn screening method using FIA-TMS (API 4000) in MRM mode. Calculated p-values for PC(16:0,9:0(COOH)), PC(18:0,5:0(COOH)) and PC(16:0,8:0(COOH)) were 1.927×10-14, 2.391×10-15 and 3.354×10-15 respectively. Next part is reporting new way for identification of novel potential biomarkers. Adenosine deaminase deficiency (ADA) belongs to the various group of inborn errors of purine metabolism. These diseases express large variety of neurological, immunological, hematological and renal manifestations. Novel approach of spectral trees (www.mzcloud.org), which uses multistage fragmentation to identify different metabolic modifications, was used. This approach allows us to see the unmodified structure of the metabolite at lower MSn level and by "bottom-up" strategy get the individual metabolic modifications thus identifying the molecule. Data were acquired using untargeted metabolomics approach by UHPLC coupled with Orbitrap Elite. Data were evaluated by Compound Discoverer 1.0.0.692 (Thermo Fisher Scientific, USA). Number of potential metabolites of adenosine and deoxyadenosine found by Compound Discoverer was 23 (12 unique m/z values). Three metabolite structures were successfully annotated according to Level 1 of MSI. The importance of MSn level was shown using spectral trees. In the future this method can represent significant tool for identification of metabolites and/or small molecules with diagnostic potential. The aim of the third part of this work was to describe influence of mass resolution on exact MS metabolomic experiments. In silico calculations based on combined peaklist (HMDB, KEGG, LipidMaps) database determined 15 722 unique masses without isobars. Number of distinguishable masses was calculated for up to 3840k resolution. Plasma samples were run LC-MS using Orbitrap Elite at up to 480k resolution. In silico, the number of unique masses plateaued at the inflection point of 240k resolution. Real plasma experiments showed - same curve shape with inflection point at 60 - 120k resolution and number of observed features above 4k. Results suggest that resolution between 60 - 120k is needed for the analyses in metabolite rich biofluids.

Abstract:

álné experimenty na plazmě ukázaly stejný tvar křivky s inflexním bodem při 60 - 120K rozlišení a počet pozorovaných "features" byl více než 4k. Výsledky naznačují, že rozlišení mezi 60 - 120k je třeba pro analýzu v metabolitů v bohatých biotekutinách.

Keywords

Metabolomika, hmotnostní spektrometrie, Orbitrap, vrozené poruchy metabolismu, MCADD, ADA, spektrální stromy

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 3. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 20. 7. 2017

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Lékařská genetika / Lékařská genetika