Zvýšení rychlosti enzymových reakcí konstruováním kondenzátů substrát-enzym

Bc. Martin Mátl

Master's thesis

Enhancing enzyme reaction rates by engineering substrate-enzyme condensates

Abstract:

Fázová separace kapalina-kapalina (LLPS) se zdá být základním biologickým organi-začním principem. Uvnitř buněk vzniká množství typů kompartmentů prostřednic-tvím slabých, multivalentních interakcí, což vede ke koacervaci biomolekul do fázově separovaných kondenzátů. Tyto kondenzáty tvoří odlišné chemické prostředí a mo-hou rekrutovat další molekuly a měnit průběh a výsledek biochemických reakcí in vivo. Kondenzáty tvořené LLPS mohou zrychlovat, zpomalovat nebo měnit specifitu reakcí. Cílem této práce bylo umožnit fázovou separaci u enzymů jako nový přístup v proteinovém inženýrství. Rekombinantní fúzní proteiny tvořené aktivní enzymovou doménou a vnitřně neuspořádanou fázově separační doménou byly připraveny a charakterizovány. Výsledné enzym-LLPS fúzní proteiny vykazovaly vyšší reakční rychlost oproti enzymu divokého typu v testech aktivity. Fázová separace byla in-dukována přídavkem molecular crowdingu a potvrzena mikroskopickým pozo-rováním. Tato práce je příkladem proteinového inženýrství aktivních enzymů prostřednic-tvím inkorporace fázově separační domény, což umozňuje enzymům využít LLPS ke zvýšení reakčních rychlostí. Budoucí studie se budou soustředit na rozklíčování příspěvků fázové separace na zrychlené reakční rychlosti a charakterizace kinetiky na úrovni jednotlivých fázi, což poskytne mechanistický vhled do těchto efektů.

Abstract:

Liquid-liquid phase separation (LLPS) has emerged as a fundamental organizing principle in biology. Many membraneless compartments within cells are proposed to form via transient multivalent interactions, leading to the coacervation of biomo-lecules into phase separated condensates. These condensates create unique environ-ments that can recruit cargo molecules and alter biochemical reacitions and their outcomes in vivo. Condensates formed via LLPS can accelerate, decelerate or alter the specificity of reactions. This thesis aimed to enable phase separation in enzymes as a novel protein engineering approach. Recombinant fusion proteins consisting of an active enzyme core and an intrinsically disordered domain capable of phase separation were prepa-red and characterized. The resulting enzyme-LLPS fusion protein exhibited higher activity than the wild type enzyme, as demonstrated by activity assays. Phase separa-tion was induced by adding a molecular crowding agent and confirmed through microscopic observations. This work demonstrates protein engineering of active enzymes by incorpora-ting a phase separating domain, exploiting LLPS to increase enzyme reaction rates. Future studies will focus on identifying the contributors to the increased reaction rates and characterizing the kinetics on a phase level to provide mechanistic insight into these effects.

Keywords

fázová separace kapalina-kapalina, nemembránové organely, enzymová kinetika, proteinové inženýrství, kondenzáty, transkripce

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 5. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 20. 6. 2024
• Supervisor: prof. Mgr. Richard Štefl, Ph.D.
• Reader: prof. Mgr. Petr Svoboda, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry