Mechanizmy působení proteinů p53 v nádorové buňce

Mgr. Robert Helma

Bachelor's thesis

Mechanisms of p53 action in tumor cell

Abstract:

Nádory mozku patří mezi vysoce invazivní typy nádorů. Inaktivace specifických genů spolu s bodovými mutacemi nádorového supresorového genu TP53 je spojena s nepříznivou prognózou. Mutantní formy p53 disponují celou řadou specifických vlastností spojených s agresivním charakterem nádorů např. inhibice apoptózy, chemorezistence, angiogeneze či zástava diferenciace prostřednictvím transkripční aktivace či represe řady cílových genů. Regulace cílových genů je předmětem intenzivního studia. Mezi mechanismy jejich regulace patří strukturně specifická vazba p53 na DNA, interakce mutantních proteinů p53 s transkripčními faktory (SP1, ETS1 aj.) a jinými proteiny (p63, p73 či TOP1). V rámci bakalářské práce byl studován vliv mutace TP53 na onkogenní chování glioblastomových linií a mechanismus působení mutantní p53. Pro analýzu byly použity jednak základní glioblastomové linie U87 (wtp53), Onda 11 (R273C), U251 (R273H), Onda 10 (G245S) a klony se sníženou expresí p53, odvozené od těchto linií (Usi 12, Usi 16, Osi 10, P1-37). V rámci naší studie byly selektovány stabilní klony odvozené od linie Onda 10 po transfekci shRNA-p53 (pSuper-p53, P1-37). Míra exprese p53 byla analyzována pomocí imunodetekce a úspěšnost integrace plazmidu pSuper-p53 do genomu linie Onda 10 byla ověřena pomocí PCR. Analýza exprese cílových genů mutp53 byla provedena na základě dat z DNA microarray analýz linií U251/Usi 12/Usi 16 a byly navrženy kandidátní geny pro další analýzy (FRMD5, JAK2, NRG1, PPARGC1A, TGFBR2 a VEGFA). Na závěr byl ověřen vliv exprese mutantního proteinu p53 na onkogenní chování, kdy bylo zjištěno, že u linií s potlačenou expresí p53 (Usi 12, Osi 10 a P1) dochází ke snížení jejich schopnosti tvořit kolonie na měkkém agaru.

Abstract:

Brain tumors belong among highly invasive types of tumors. Inactivation of specific genes along with point mutations of tumor suppressor gene TP53 is linked to poor prognosis. Mutant forms of p53 manage quite a number of specific abilities, associated with aggressive character of tumors e. g. inhibition of apoptosis, chemoresistance, angiogenesis or differentiation block, through transcriptional activation or repression of series of genes. Regulation of target genes is a subject of intensive studies. Into mechanisms of their regulation are involved a structure-specific DNA binding of p53, interaction of p53 mutants with transcriptional factors (SP, ETS1 et al.) and other proteins (p63, p73 or TOP1). In this thesis an influence of TP53 mutation and mutant p53 driven mechanism on oncogenic behaviour of glioblastoma cell lines was studied. Parental glioblastoma cell lines U87 (wtp53), Onda 11 (R273C), U251 (R273H), Onda 10 (G245S) and derived clones with reduced expression of p53 (Usi 12, Usi 16, Osi 10, P1-37) were used for analysis. Stable clones derived from Onda 10 cell line were selected after transfection of shRNA-p53 (pSuper-p53, P1-37). The amount of p53 expression on protein level was analysed by using immunodetection. Successful integration of plasmid pSuper-p53 into the genome of Onda 10 cell line was controlled by PCR. Analysis of mutp53 target genes expression was performed on the basis of DNA microarray data. We analyzed cell line system U251/Usi 12/Usi 16 and suggested couple of a mutp53 target genes, suitable for further analysis (FRMD5, JAK2, NRG1, PPARGC1A, TGFBR2, VEGFA). An influence of mutant p53 expression on oncogenic behaviour was detected by soft agar colony formation assay. The cell lines with repressed expression of mutp53 (Usi 12, Osi 10 and P1) were less able to form colonies in soft agar.

Keywords

wild-type p53, mutantní p53, transkripční aktivita, gain of function, regulace p53, mutant p53, transcriptional activity, regulation of p53

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 5. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 18. 6. 2012
• Supervisor: Mgr. Marie Brázdová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry