Specifické C- terminální endoproteinázy: kinetika, imobilizace, aplikace

Bc. Miroslava Jandová

Master's thesis

Specific C- terminal endoproteinases: kinetics, immobilization, application

Abstract:

Diplomová práce byla zaměřena na přípravu magnetického mikroreaktoru s imobilizovanou endoproteinázou Arg-C (Clostripain). Jako vhodné nosiče byly vybrány magnetické částice s karboxylovými, aminovými, hydrazidovými, kyanurátovými a polyglutaraldehydovými funkčními skupinami. Na základě výsledků byl vybrán nejvhodnější nosič, u něhož byla také stanovena skladovací a operační stabilita imobilizovaného Clostripainu. Aktivita solubilního a imobilizovaného Clostripainu byla ověřena pomocí substrátu BAEE (N?-benzoyl-L-arginin-ester). Přírustek produktu byl měřen kineticky jako závislost změny absorbance na čase. Z kinetických údajů byla pro solubilní a imobilizovaný Clostripain stanovena Michaelisova konstanta, charakterizující katalytické vlastnosti enzymu vzhledem k příslušnému substrátu. V poslední části diplomové práce byla ověřena specifita obou forem Clostripainu pomocí štěpení modelového proteinu BSA (hovězí sérový albumin). Byly optimalizovány podmínky enzymové fragmentace (teplota, doba štěpení, poměr E:S). Vzorky byly analyzovány elektroforeticky pomocí SDS-PAGE a pomocí MALDI-TOF-MS.

Abstract:

Presented thesis was focused on preparation of magnetic microreactor with immobilized endoproteinase Arg-C (Clostripain). Magnetic particles with carboxyl, amino, hydrazide, cyanuric and polyglutaraldehyde function groups were chosen. Based on results, the most convenient carrier was selected, where the storage and operational stability was determined. The substrate BAEE (N?-benzoyl-L-arginin-ester) was used to confirm the activity of soluble and immobilized Clostripain. The product was measured kinetically in time course results in absorbance dependence on time. Michaelis constant (KM) for soluble and immobilized Clostripain was determined. This kinetic parameter characterizes catalytic properties of enzyme in regard of appropriate substrate. Last step of the thesis was to verify the specifity of both Clostripain forms using enzymatic digestion of BSA (bovine serum albumine) as model protein. Conditions of fragmentation (temperature, digestion time, E:S ratio) were optimized. Samples were analyzed by SDS-PAGE and by MALDI-TOF-MS.

Keywords

endoproteináza Arg-C, Clostripain, imobilizace enzymů, specifické endoproteinázy

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 3. 6. 2008
• Supervisor: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Master programme / field:
Special Chemical and Biological Programmes / Analysis of Biological Materials