Vliv separačních podmínek na funkční vlastnosti granulocytů izolovaných z periferní lidské krve

Bc. Lenka Hromádková

Diplomová práce

Effect of Separation Methods to the Functional Properties of Peripheral Blood Granulocytes

Anotace:

Diplomová práce je členěna na dvě hlavní osnovní části: teoretickou část a experimentální část. V teoretické části jsou shrnuta fakta o nejvíce zastoupené populaci fagocytujících granulocytů - neutrofilech. Je blíže popsán proces fagocytózy a základní mechanismy v obraně proti cizorodým agens. Následuje popis průtokového cytometru a jeho hlavních součástí. Jsou ukázány možnosti využití průtokového cytometru v analýze funkčních vlastností neutrofilů jako významného analytického nástroje v diagnóze imunodeficiencí souvisejících s buněčnou přirozenou imunitou. Cílem předkládaného experimentu byla optimalizace metody třídění granulocytů periferní krve na průtokovém třídiči buněk s ohledem na následně prováděnou analýzu fagocytární aktivity měřenou jako míru oxidativního vzplanutí po stimulaci buněčnou suspenzí inaktivovaných bakterií E.coli. Byla také analyzována míra apoptózy. V prvé řadě byla nutná úprava vzorku nesrážlivé periferní krve před vlastním tříděním granulocytů. Na základě výsledků fagotestu byla úprava prováděna sedimentací periferní krve v inzulinových stříkačkách o objemu 1 ml po dobu 30 minut při laboratorní teplotě. Měnícím parametrem průtokového třídiče buněk byl průměr otvoru nozzlu. Analýzy byly prováděny při třech různých průměrech: 70 ?m, 85 ?m a 100 ?m. Bylo zjištěno, že již vlastní separace granulocytů třídičem buněk měla vliv na jejich schopnost fagocytózy a tvorbu ROS. Byly zjištěny významné rozdíly středních hodnot fluorescence (MFI) granulocytární populace v závislosti na použitém nozzlu.

Abstract:

The thesis is divided into two main warp parts: a theoretical part and an experimental part. The theoretical section summarizes the facts about the most abundant population of phagocytic granulocytes - neutrophils. It is described in more detail the process of phagocytosis, and the fundamental mechanisms of defense against foreign agents. The following part is a description of the flow cytometer and its main components. There is also indicated the possibility of using flow cytometry in the analysis of functional properties of neutrophils as an important analytical tool in the diagnosis of immunodeficiency associated with cellular innate immunity. The aim of the experiment was to optimize methods for sorting of granulocytes in peripheral blood by cell sorter with regard to the subsequent analysis of phagocytic activity as measured by degree of oxidative burst after stimulation with cell suspension of inactivated E.coli . It was also analyzed the rate of apoptosis. First, it was necessary to optimalize sample preparation of human peripheral blood. Based on the results of phagotest, the peripheral blood had been settling in the insulin syringes of 1 ml for 30 minutes at room temperature. Nozzle diameter in the flow cytometer was the parameter that was changed. Analyses were performed at three different diameters : 70 micron , 85 micron and 100 micron. It was found that already own cell sorter separation of granulocytes had an impact on their ability to phagocytosis and ROS production . There were significant differences of mean values of fluorescence (MFI) of granulocyte population depending on the nozzle.

Klíčová slova

granulocyt, průtoková cytometrie, apoptóza, oxidativní vzplanutí

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 4. 5. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 5. 6. 2012
• Vedoucí: doc. MVDr. Zuzana Šinkorová, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Analýza biologických materiálů