Identifikace mikroorganismů pomocí profilu mastných kyselin

Mgr. Eva Krejčí, Ph.D.

Disertační práce

Identification of bacteria on the basis of their fatty acid patterns

Anotace:

Tato disertační práce se zabývá možnostmi identifikace bakterií pomocí rozdílů ve složení mastných kyselin. Klinické izoláty rodu Aeromonas a skupiny Burkholderia cepacia komplex byly identifikovány na základě kombinace výsledků fenotypových (fenotypová identifikace, analýza mastných kyselin) a genotypových metod (ribotypizace, analýza částečné sekvence genu pro 16S rRNA, recA PCR). Využití mastných kyselin k odlišení zástupců výše uvedených taxonů bylo hodnoceno zpětně pomocí srovnání profilů či jednotlivých zastoupených mastných kyselin. Na základě získaných výsledků lze potvrdit, že mastné kyseliny mohou být využity k jednoznačnému odlišení fenotypově příbuzných zástupců a případně i ke zpřesnění identifikace v rámci jmenovaných bakteriálních taxonů. Zařazení Aeromonas agaru do rutinního vyšetřování zvýšilo záchyt aeromonád ze vzorků stolic; analýza mastných kyselin může sloužit k potvrzení rodové identifikace – odlišení rodů Aeromonas (přítomnost mastné kyseliny iso-C17:1 w9c) a Vibrio (C12:0 3OH). Porovnávání profilů mastných kyselin s referenčními kmeny lze využít k identifikaci a do jisté míry i ke stanovení identity dvou izolátů aeromonád. Nebylo prokázáno, že by v práci popsané závažné případy akutních průjmů u malých dětí souvisely s jedním konkrétním druhem rodu Aeromonas. Nálezy kmenů A. caviae však převažovaly. Poprvé v České republice byla prokázána A. hydrophila subsp. dhakensis známá svou produkcí četných faktorů virulence; kmeny A. hydrophila subsp. dhakensis mohou představovat riziko především pro imunokompromitované pacienty. Analýza hlavních komponent vycházející z výsledků analýzy mastných kyselin se osvědčila k odlišení poddruhů A. hydrophila subsp. hydrophila a A. hydrophila subsp. dhakensis (diferenciace dle minoritních mastných kyselin C13:0 a C17:1 w8c). Analýza mastných kyselin je schopna potvrdit také zařazení do Burkholderia cepacia komplexu a v rámci skupiny charakterizovat druhy B. vitenamiensis, B. ambifaria a B. pyrrocinia. Diagnostické mastné kyseliny mohou sloužit jako taxonomický znak a byly využity k sestavení identifikačního klíče (na základě obsahu mastných kyselin C16:0 3OH, C12:0 2OH, C14:0 2OH, C12:0, C14:0 a C18:0). U druhu B. cenocepacia byla prokázána mastná kyselina C12:0. K dosažení správné identifikace byly výsledky analýzy mastných kyselin hodnoceny spolu s výsledky dalších metod polyfázickým taxonomickým přístupem. Výskyt atypického profilu mastných kyselin poukazuje na trvající problém existence variability a heterogenity fenotypu druhu B. cenocepacia.

Abstract:

This dissertation deals with the possibility to identify bacteria on the basis of the different amount in their fatty acid composition. The results of phenotypic methods (phenotypic identification, fatty acid analysis) and of genotypic methods (ribotyping, partial analysis of the 16S rRNA gene sequence, recA PCR) were combined to identify clinical isolates that belonged to the Aeromonas genus, and to the Burkholderia cepacia complex. The use of fatty acids for the differentiation of the representatives of taxons mentioned above has been evaluated retrospectively through the comparison of profiles or individual fatty acids. The obtained results confirm that the fatty acid analysis is useful to unambiguously separate both taxons from their phenotypicaly close relatives and in some cases, even to discern the members of these taxons. The inclusion of the Aeromonas agar in the routine processing increased the frequency of aeromonads isolated from human faeces; on the basis of the fatty acids it is possible to differentiate genera Aeromonas (occurrence of the iso-C17:1 w9c fatty acid) and Vibrio (C12:0 3OH fatty acid). Comparison of the fatty acid profiles with the reference strains could be used for the identification and partially also for the recognition of the identity of Aeromonas isolates. The serious cases of acute diarrhoea in children under one year of age, that have been described, do not correlate with one specific Aeromonas species, but the results suggest the predominant role of A. caviae. The first occurrence in Czech Republic of the less frequent and more virulent A. hydrophila subsp. dhakensis subspecies was documented. This subspecies might to a great extent constitute a risk to immunocompromised patients. The principal component analysis based on the fatty acid results was proved to discern subspecies of A. hydrophila subsp. hydrophila and A. hydrophila subsp. dhakensis (differentiation according to the minor fatty acids C13:0 and C17:1 w8c). Fatty acid analysis was also able to confirm identification as Burkholderia cepacia complex and discriminate between species B. vitenamiensis, B. ambifaria and B. pyrrocinia. The diagnostic fatty acids can be applied as taxonomic markers and they were used for construction of the identification key (according to the amount of fatty acids C16:0 3OH, C12:0 2OH, C14:0 2OH, C12:0, C14:0 and C18:0). In B. cenocepacia species the C12:0 fatty acid was proved, in that case the fatty acid analysis was used as one of the various methods in polyphasic approach. The occurrence of this atypical fatty acid profile pointed out the problem of the variability and heterogeneity in B. cenocepacia phenotype.

Klíčová slova

mastné kyseliny, FAME, Aeromonas, Burkholderia cepacia komplex, identifikace, fenotypizace, ribotypizace, 16S rRNA, recA PCR, lékařská mikrobiologie fatty acids, Burkholderia cepacia complex, identification, phenotyping, ribotyping, clinical microbiology

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 12. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 15. 12. 2006
• Vedoucí: doc. RNDr. Miroslav Němec, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie / Mikrobiologie