Enzymy imobilizované na magnetických mikročásticích: Aplikace v proteomice a metabolomice

Bc. Lukáš Zeman

Master's thesis

Enzymes immobilized on magnetical microparticles: Application in proteomics and metabolomics

Abstract:

Enzymy jsou biologické katalyzátory hrající klíčovou roli při udržování homeostázy, vývoji a rozmnožování všech živých organismů. Katalyzují tak prakticky všechny chemické reakce i v těle člověka, a proto stanovení jejich aktivity představuje jeden z nejčastěji prováděných úkonů v biochemii a molekulární biologii. Při těchto studiích je žádoucí zaručit stabilitu enzymu, čehož lze s výhodou dosáhnout pomocí technik imobilizace. Mimo to, vazba enzymu na magnetický nosič umožňuje rychlé odstranění z reakční směsi, a tím ukončení reakce. Dále pak jeho opakované využití a mnohdy i zvýšení enzymové aktivity. Jednou z technik, které jsou vhodné ke studiu charakteristiky enzymů, je kapilární elektroforéza. Jedná se o progresivní analytickou techniku s vysokou separační účinností a spotřebou malých vstupních objemů v řádu nl, která je obzvláště žádoucí při analýzách s cennými enzymy. V předložené práci jsou zavedeny metody pro imobilizace trypsinu a cytochromu P450 2C9 na magnetických mikročásticích. Praktická využitelnost imobilizovaného trypsinu byla představena na proteolytickém štěpení modelového polypeptidu lysozymu. V případě cytochromu P450 2C9 byla provedena kinetická studie s modelovým substrátem diklofenakem, potvrzující využitelnost imobilizovaného systému v rámci rané fáze vývoje nových léčiv.

Abstract:

Enzymes are biological catalysts that play the key role in maintaining of homeostasis, maturation and reproduction of all living organisms. They catalyze virtually all the chemical reactions in the human body, and the enzyme activity assays represent one of the most frequently encountered procedures in biochemistry and molecular biology. In these studies, it is important to guarantee enzyme stability, which can be preferably achieved by techniques of enzyme immobilization. Furthermore, binding of the enzyme to the magnetic carrier allows their quick removal from the reaction mixture, and thereby termination of the reaction, their re-use and often increase of enzyme activity. One of the techniques that are suitable to the study of the characteristics of enzymes is capillary electrophoresis. It is a progressive analytical technique with high separation efficiency and small (nl) volumes consumption, which is particularly suitable in the analysis of expensive enzymes. In the present work methods for immobilization of trypsin and cytochrome P450 2C9 on magnetic microparticles are presented. The practical usability of immobilized trypsin was proved on proteolytic digestion of the model polypeptide lysozyme. In the case of cytochrome P450 2C9, a kinetic study with the model substrate diclofenac was performed confirming the usability of the immobilized system in the early stages of drug development.

Keywords

Kapilární elektroforéza, Imobilizace enzymů, Trypsin, Cytochromy P450, Isoforma 2C9, Diklofenak, Capillary electrophoresis, Enzyme immobilization, Cytochrome P450, 2C9 isoform, Diclofenac

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 5. 6. 2013
• Supervisor: prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry