Stanovení imunoglobulinů (IgM) u ryb

Bc. Libor Vojtek, Ph.D.

Diplomová práce

IgM determination in fish

Anotace:

Imunitní systém ryb je stejně jako imunitní systém obratlovců složen ze specifických a nespecifických složek buněčné a humorální imunity. Hlavní součástí specifické humorální imunity jsou protilátky - imunoglobuliny (Ig). Ig se specificky váží na antigen a zpřístupňují jej ostatním složkám imunitního systému. U ryb byl na rozdíl od vyšších obratlovců popsán pouze IgM, který se většinou nachází ve formě tetrameru. Pro stanovení rybího IgM je využíváno mnoha metod, v této práci byly dopodrobna popsány následující čtyři: sendvičová ELISA pro stanovení protilátek, imunoturbidimetrie, srážení síranem zinečnatým a elektroforéza. Prakticky byly vyzkoušeny všechny 4 jmenované metody, z čehož nejlépe fungovalo srážení síranem zinečnatým – ZST. Všechny vzorky tedy byly na závěr vyhodnoceny metodou srážení síranem zinečnatým. Srážení síranem zinečnatým (ZnSO4 . 7H2O) je jednoduchá, levná a časově nenáročná metoda, která využívá fyzikálně – chemických vlastností ZnSO4 . 7H2O. Metoda je běžná ve veterinární praxi, pro zpracování rybích vzorků byla dle dostupných informací použita poprvé. ZnSO4 . 7H2O odebírá selektivně imunoglobulinům v roztoku vodu a ty poté z roztoku vypadávají – vzniká sraženina. Metoda je doplněna stanovením bílkovin, kdy se výsledná koncentrace IgM rovná rozdílu mezi bílkovinami obsaženými v celém vzorku a v supernatantu po vysrážení IgM. Pro experimenty byla použita plasma kapra obecného (Cyprinus carpio) odebíraná v různých ročních obdobích, lína obecného (Tinca tinca) s různými ploidiemi a karase stříbřitého (Carassius auratus) s různými ploidiemi, včetně jeho kříženců. U kapra obecného byla zjištěna statisticky významná sezónní dynamika hladiny IgM s nejvyššími průměrnými hodnotami v červnu 20,15 g/l a nejnižšími v srpnu 12,42 g/l. Rovněž byly u kapra obecného zaznamenány statisticky významné rozdíly mezi pohlavími, s vyššími průměrnými hodnotami IgM u samic, kdežto u lína obecného rozdíly mezi pohlavími nalezeny nebyly. Diploidní (2n), triploidní (3n) a gynogenní (G) skupiny lína se statisticky významně liší, G ryby mají průměrně vyšší hladinu IgM než 2n a 3n. 2n a 3n karasi se statisticky neliší, i když průměrná hladina IgM 2n je nižší než 3n a kříženců.

Abstract:

The fish immune system as well as the immune system of other vertebrates consists of cellular or humoral specific and nonspecific factors. Main components of the specific humoral immunity are antibodies – immunoglobulins (Ig). Ig specifically bind the antigen and make it available for other components of the immune system. In contrast to the higher vertebrates, only tetrameric IgM, has been found in fish. There are many methods for IgM determination in fish. In this thesis, four of them was used and compared: sandwich ELISA for the antibodies, immunoturbidimetry, zinc sulphate precipitation and electrophoresis. From these four methods, zinc sulphate precipitation was shown to be the most efficient. Therefore were all 284 samples at the end determined by ZST. Zinc sulfate (ZnSO4 . 7H2O) precipitation is simple, cheap, fast method, based on physico-chemical properties of ZnSO4 . 7H2O. This method is basically used in mammals veterinary medicine, this is the first use for fish samples. Zinc sulfate specifically dehydrates proteins, which come out from the solution – rising precipitate. Proteins determination is also included in the method - the final IgM concentration rate, is than expressed by difference, between protein concentration in the whole sample and the protein concentration in the supernatant after precipitation. Common carp (Cyprinus carpio) blood plasma samples were collected in several year seasons. In following experiments samples obtained from different ploidity common tench (Tinca tinca) and goldfish (Carassius auratus) were used. Statistically significant differences in seasonal dynamics of blood IgM concentration in common carp were observed. Highest average values were determined in June (20,15 g/l) and lowest in August (12,42 g/l). Also in carp gender comparison the statistical significant differences were observed. Average values in females were a little bit higher than in males. There were no statistically significant differences between males and females in common tench. Diploid (2n), triploid (3n) and gynogenetics (G) forms of common tenches have no statistically significant differences, but G fish has higher average values of IgM than 2n and 3n fish. 2n and 3n goldfish have no statistically significant differences, but 2n fish have lower average values of IgM than 3n and crossbreeds.

Klíčová slova

Imunoglobuliny, ryby, IgM, srážení síranem zinečnatým, ELISA, imunoturbidimetrie, elektroforéza, kapr obecný, lín obecný, karas stříbřitý Immunoglobulins, fish, zinc sulfate test, immunoturbidimetry, electrophoresis, common carp, common tench, goldfish

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 5. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 11. 6. 2009
• Vedoucí: doc. RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Obecná biologie