Úloha kyseliny abscisové v raném vývoji semenáčku rajčete (Solanum lycopersicum L.)

Mgr. Jan HUMPLÍK

Doctoral thesis

A role of abscisic acid in tomato (Solanum lycopersicon L.) early seedling development.

Abstract:

This Ph.D. thesis is dedicated to physiological effects of abscisic acid (ABA) during early development of tomato seedlings. More specifically, it is focused on the influence of ABA on hypocotyl elongation. The aims of the thesis are: 1. Systematic study of the ABA metabolic changes during early development of tomato seedlings. 2. Physiological study of the effects of endogenous ABA in the early development especially in the growth of hypocotyl of etiolated seedlings. 3. Cellular and molecular study of potential mechanisms of ABA action in the growth of etiolated tomato hypocotyls. First experiments were performed to analyze changes in the endogenous ABA content during seed imbibition, germination, etiolated and de-etiolated growth of tomato seedlings. It was observed that after dramatic decrease of ABA during seed germination in the dark, the ABA content increases again after the radicle protrusion. Interestingly, this increase in ABA was double-fold higher in the etiolated seedlings in comparison to the same aged seedlings that were grown after germination in blue-light. The corresponding pattern was observed also in the expression of key gene for ABA biosynthesis in tomato LeNCED1. Further, the effect of ABA-deficiency in the growth of etiolated hypocotyl was studied using two mutants sitiens and notabilis that are impaired in different steps of ABA biosynthesis. The reduced hypocotyl growth in the mutants was observed when compared to the wild-types (WTs). When the exogenous ABA (100 nM) was added to the mutants their hypocotyl growth was improved to the WTs levels. The treatment of WT by ABA has no effect on hypocotyl elongation up to concentration of 1 ?M, higher concentration led to the growth inhibition. The effect of ABA-deficiency was also mimicked by using of inhibitor of ABA biosynthesis fluridone that caused reduced hypocotyl elongation in etiolated WT seedlings. Detailed analysis of the mutant sitiens showed that ABA-deficiency led to the reduced growth of epidermal cells in etiolated hypocotyl. Since important factors in cell expansion are endopolyploidic cycles, the flow-cytometry analysis of DNA content was performed. The importantly reduced number of endoreduplicating cells was observed in the sitiens mutant in comparison with the WT. In parallel, the reduced expression of the cyclin-dependent kinases inhibitory proteins (ICK/KRPs) that affect the rate of endoreduplication in plants was observed in mutant hypocotyls. When the exogenous ABA was applied, these cellular and molecular parameters were improved to the levels of WT. In other experiments it was shown that ABA-deficiency caused overproduction of certain cytokinin metabolites and highly increases overall cytokinin content. Cytokinins support cell division but inhibit DNA endoreduplication and cell expansion, causing the inhibition of hypocotyl growth. The subsequent analysis of cytokinins showed important increase especially in isopentenyladenine metabolites in de-etiolated WT seedlings. De-etiolation was induced by blue-light that is strong inducer of plant photomorphogenesis. Based on the results, we concluded that in dark conditions ABA supports the growth of etiolated hypocotyls via inhibition of cytokinin biosynthesis and stimulation of DNA endoreduplication and cell expansion. Conversely, cultivation of seedlings in light conditions leads to the inhibition of ABA synthesis, stimulation of cytokinins (especially of isopentenyladenine metabolites) and to subsequent reduction in the DNA endoreduplication and cell expansion that finally leads to the inhibition of hypocotyl growth. Thus endogenous abscisic acid should not be considered as general inhibitor of plant growth, since a least in tomato early seedling development it works as a growth promoter.

Abstract:

Disertační práce je věnována fyziologickým účinkům kyseliny abscisové (ABA) v raném vývoji semenáčků rajčete, konkrétně jejím vlivem na prodlužování hypokotylů. Cíle této práce jsou: 1. Systematická studie metabolických změn ABA v průběhu rané ontogeneze semenáčků rajčete a jejich ovlivnění světlem. 2. Studium fyziologických účinků změněné hladiny ABA na vývoj semenáčků rajčete. 3. Zkoumání možných mechanismů účinků ABA na buněčné a molekulární úrovni. První typ experimentů se zabýval změnou hladiny ABA v průběhu bobtnání, klíčení, etiolovaného a světelného růstu semenáčků rajčete. Bylo zjištěno, že po počátečním prudkém poklesu hladiny ABA v průběhu klíčení, dochází po vyklíčení k nárůstu hladiny endogenní ABA v semenáčcích. Tento nárůst byl přibližně dvojnásobně větší u etiolovaných rostlin ve srovnání se stejně starými rostlinami, které po vyklíčení ve tmě byly přeneseny na modré světlo. Obdobná reakce byla zjištěna i u exprese klíčového biosyntetického genu pro ABA LeNCED1. Dále byl hodnocen růst dvou etiolovaných mutantů rajčete sitiens a notabilis, mutovaných v rozdílných krocích biosyntézy ABA. Bylo pozorováno, že mutované semenáčky, mají zkrácený růst hypokotylu. Pokud byla k mutantům přidána exogenní ABA (100 nM) růst hypokotylu mutovaných rostlin se zcela vyrovnal růstu nemutované kontroly. Na nemutované semenáčky (WT) neměla exogenní aplikace v koncentracích do 1 ?M žádný vliv, vyšší koncentrace vedly k inhibici jejich růstu. Vliv nedostatku ABA na růst etiolovaných hypokotylů, byl rovněž studován aplikací inhibitoru biosyntézy ABA fluridonu, který také vedl k inhibici růstu. Detailní analýza mutanta sitiens ukázala, že nedostatek ABA vede k inhibici expanze epidermálních buněk hypokotylu. Jelikož jedním z významných faktorů ovlivňujících buněčnou expanzi jsou endopolyploidizační cykly, byla provedena analýza obsahu DNA v buňkách hypokotylu mutantních a WT rostlin pomocí průtokové cytometrie. Zde byl pozorován významný pokles počtu endoreduplikujících buněk u mutanta sitiens ve srovnání s WT. Zároveň byla prokázána snížená exprese genů kódujících inhibitory cyklin-dependetních kináz (ICK/KRP), které endoreduplikaci podporují. Po aplikaci exogenní 100nM ABA došlo ke srovnání zmíněných parametrů na úroveň WT. V dalších experimentech bylo zjištěno, že nedostatek ABA vede k výrazné nadprodukci některých cytokininových metabolitů. Cytokininy podporují buněčné dělení na úkor endoreduplikace a vedou tak k inhibici buněčné expanze a následně také k inhibici růstu hypokotylu. Na základě získaných výsledků, byl vyvozen závěr, že ve tmě ABA přispívá k růstu etiolovaných hypokotylů, tím že inhibuje biosyntézu cytokininů, podporuje endoreduplikaci DNA a buněčnou expanzi. Naopak, za světelných podmínek dochází k inhibici syntézy ABA a ke zvýšené syntéze cytokininů, k inhibici buněčné expanze ve prospěch dělení a diferenciace buněk. Endogenní kyselina abscisová by tedy neměla být generalizována jako inhibitor růstu, jelikož minimálně v podmínkách raného vývoje semenáčků rajčete působí jako stimulátor.

Keywords

kyselina abscisová, modré světlo, cytokininy, de-etiolace, endopolyploidie, endoreduplikace, etiolovaný růst, hypokotyl, notabilis, photomorphogeneze, vývoj semenáčku, sitiens, skotomorphogeneze, Solanum lycopersicum L., Rajče jedlé

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 10. 2015

Accessible from:: 12. 10. 2015

Thesis defence

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology / Botany