Studium funkce NADPH-oxidas a duálních oxidas v imunitních odpovědích včely medonosné

Bc. Adam KIŠKA

Diplomová práce

Studies of functions of NADPH oxidases and dual oxidases in immune responses of honey bees

Anotace:

Teoretická část diplomové práce je zaměřena na charakterizaci reaktivních forem kyslíku a antioxidačních systémů a jejich funkci v organismech obecně. Dále se práce zaobírá NADPH a duálními oxidasami (Nox a Duox) hmyzu, především včel medonosných, a jejich úlohou v imunitě a signalizaci. Důraz byl kladen na popis imunitních procesů v trávicí soustavě, kde Nox a Duox hrají významnou roli v interakci střevního epitelu s mikroby. Poslední část literární rešerše se zabývá problematikou metod stanovení reaktivních forem kyslíku a popisem fluorescenčních prób používaných v experimentální části práce. Experimentální část práce je zaměřena na srovnání fluorescenčních metod využívaných ke kvantifikaci H2O2 a jejich optimalizace při stanovování aktivity Nox a Duox ve vzorcích trávicí soustavy včel. Další práce byla zaměřena na kvantifikaci obsahu H2O2 v trávicí soustavě včel vystavených modelovému imunitnímu elicitoru (bakteriálním lipopolysacharidům LPS) a induktoru oxidativního stresu (herbicidu paraquatu PQ). Poslední část práce se zabývá využitím fluorescenční próby R19S k histochemické detekci produktu duálních oxidas (HClO) v trávicí soustavě včel. Ze srovnání fluorescenčních prób vyšla jako jediná použitelná v homogenátech AmplexRed. Ta byla dále použita k měření koncentrace H2O2 v trávicích soustavách včel ovlivněných LPS a PQ. Ukázalo se, že PQ ovlivňuje tvorbu ROS pouze v prvních 2 h. Při vystavení včel LPS byla tvorba ROS závislá spíše na stáří včel; naměřené hladiny H2O2 navíc nekorelují s aktivitou Nox/Duox. Histochemickou metodou s R19S byla potvrzena tvorba HClO ve střevech včel po indukci uracilem.

Abstract:

The theoretical part of the thesis is focused on the characterization of reactive oxygen species and antioxidant systems and their function in organisms in general. Furthermore, the thesis focuses on NADPH and dual oxidases (Nox and Duox) in insects, especially honey bees, and their role in immunity and signalling. Emphasis has been placed on the description of immune processes in the digestive system, where Nox and Duox play an important role in the interactions of the intestinal epithelium with microbes. The last part of the literature review deals with the methods of reactive oxygen species determination and description of fluorescence assays used in the experimental part of the work. The experimental part of the thesis is focused on the comparison of fluorimetric methods used for H2O2 quantification and their optimization in the determination of Nox and Duox activity in bee digestive system samples. Further work focused on the quantification of H2O2 content in the digestive system of bees exposed to a model immune elicitor (bacterial lipopolysaccharides LPS) and an inducer of oxidative stress (herbicide paraquat PQ). The last part of the thesis deals with the use of R19S as a fluorescent probe for the histochemical detection of the dual oxide product (HClO) in the digestive system of bees. From the comparison of fluorescence assays, AmplexRed was the only one applicable in homogenates. It was further used to measure H2O2 concentrations in the digestive systems of bees affected by LPS and PQ. It was shown that PQ affects ROS production only in the first 2 h. When bees were exposed to LPS, ROS production was dependent on the age of the bees; in addition, the measured H2O2 levels do not correlate with Nox/Duox activity. The histochemical method with R19S confirmed formation of HClO in the gut of bees after induction with uracil.

Klíčová slova

Duální oxidasy, imunita, NADPH-oxidasy, octomilka obecná, reaktivní formy kyslíku, signalizace, včela medonosná

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 2. 5. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. Mgr. Marek Petřivalský, Dr.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie a genové inženýrství / Biotechnologie a genové inženýrství