Studium repetitivních sekvencí pohlavních chromosomů Silene Latifolia

Mgr. Zdeněk Kubát, Ph.D.

Doctoral thesis

Study of repetitive sequences on sex chrmosomes of Silene latifolia

Abstract:

Abstrakt – Studium repetitivních sekvencí na chromozomu Y Silene latifolia Jednou z významných otázek evoluční biologie je vznik a vývoj pohlavních chromozomů. Zatímco většina pohlavních chromozomů živočichů dospěla do velmi vysokého stupně evoluce, mezi rostlinami najdeme mnoho druhů, jejichž pohlavní chromozomy stojí teprve na začátku cesty a demonstrují procesy formující jejich vývoj v časných stadiích evoluce. Zajímavý je především samčí chromozom Y, který ztrácí možnost rekombinovat a stává se tak unikátním ostrovem v genomu se stíženou schopností nápravy změn, které se na něm přihodí. Evolučně mladý pohlavní chromozom Y dvoudomé rostliny Silene latifolia je největším chromozomem u tohoto druhu a je dokonce asi o 40 % větší než X, s nímž v současnosti rekombinuje už jen v krátkém úseku raménka q. Soudí se, že evoluce strukturně odlišných pohlavních chromozomů z páru autozomů zahrnuje postupnou zástavu rekombinace mezi proto-X a proto-Y chromozomy. Nerekombinující oblasti chromozomu Y podléhají degenerativním procesům, ztrácejí důležité geny a akumulují repetitivní DNA. Akumulace repetitvních sekvencí je pravděpodobně jednou z hlavních příčin nárůstu velikosti pohlavního chromozomu Y. V této práci jsme se zaměřili na studium sekvencí, které vykazují vyšší akumulaci na chromozomu Y Silene latifolia než na ostatních chromozomech a které mohou přispívat k velikosti chromozomu Y. Ačkoli je endosymbiotický transfer genů z organel do jádra znám již poměrně dlouho, dosud se neví, zda-li se organelová (“promiskuitní”) DNA začleňuje přednostně do některých oblastí genomu. V této práci jsme izolovali BAC klon obsahující chloroplastovou DNA, který hybridizoval na chromozomu Y asi 3,3krát silněji než na ostatních chromozomech. To značí, že se na chromozomu Y akumulují chloroplastové sekvence a mohou přispívat k jeho velikosti. K analýzám výskytu chloroplastových sekvencí na pohlavních chromozomech byly využity knihovny klonů amplifikovaných metodou DOP-PCR specifické pro chromozomy X a Y. Porovnávání vybraných sekvencí prokázalo vysokou identitu chloroplastových genových sekvencí lokalizovaných na chromozomech X a Y s původní chloroplastovou DNA. Nízká divergence chloroplastových sekvencí na X a Y tedy indikuje příliš krátký čas na vznik většího množství mutací, nedávný přenos do jádra a pravděpodobně vysokou rychlost inzerční a eliminační obměny chloroplastové DNA v jádře. Mobilní elementy jsou genetickými parazity eukaryot i prokaryot. Šíří se v genomu hostitele, mohou poškozovat jeho geny a zvětšovat genom. LTR retrotranspozony jsou třídou mobilních elementů. Šíří se duplikativním mechanizmem prostřednictvím RNA intermediátu. V této práci jsme popsali novou rodinu Ty3/gypsy retrotranspozonů skládající se ze dvou členů. Autonomního elementu Retand-2 (11,1 kb dlouhý), který obsahoval kompletní sadu genů důležitých pro retrotranspozici, a neautonomního Retand-1 (3,7 kb dlouhý) mobilizovatelného svým autonomním partnerem. Tyto dva elementy mají téměř shodné dlouhé koncové repetice (LTR, long terminal repeat). Elementy Retand jsou v genomu Silene latifolia přítomny ve vysokém počtu kopií. Abundance retrotranspozonů Retand byla odhadnuta na asi 2100 kopií neautonomních a 2700 kopií autonomních elementů Retand na haploidní genom. Téměř poloviční podíl neautonomních elementů na celé populaci je důkazem velké úspěšnosti jejich transpozice. Expresními analýzami několika částí Retand-2 provedenými na cDNA z různých tkání bylo dokázáno, že Retand-2 je stále funkční exprimovaný element. Orgánová specifita transkripce nebyla potvrzena. Retand je přítomen i u dalších druhů rodu Silene. Překvapením byl nález dvou dalších otevřen

Abstract:

ých čtecích rámců s neznámou funkcí označených jako ORF3 a ORF4 v opačné orientaci na 3’ konci. Zajímavou vlastností elementů Retand je přítomnost tandemové repetice uvnitř elementu. Tato sekvence nazvaná STR1 (Silene Tandem Repeat) je méně amplifikovaná v autonomním elementu. Je možné, že retroelementy hrají úlohu v šíření tandemových repeticí v genomu. Analyzovali jsme také LTR sekvence elementů Retand amplifikované na laserem mikrodisektovaných chromozomech X, Y a autozomech Silene latifolia. LTR z chromozomu Y stejně jako sekvence z X tvořily samostatné skupiny odlišné od LTR pocházejících z autozomů. LTR lokalizované na chromozomu Y byly navíc méně divergované než ty z chromozomu X a autozomů. LTR pocházející z chromozomu Y tedy vykazují vysokou vnitrochromozomovou homogenitu. To může být vysvětleno homogenizačním procesem jako například genovou konverzí, která pracuje intenzivněji na nerekombinujícím chromozomu Y. Mikrosatelity jsou všudypřítomné rychle evolvující repetice. Soudí se o nich, že jsou prvními kolonizátory genomových oblastí, ve kterých došlo k zástavě rekombinace. Protože zástava rekombinace chromozomu Y u Silene latifolia pravděpodobně neproběhla v jediném kroku, nýbrž probíhá postupně, dá se předpokládat, že na něm nalezneme oblasti s různou mírou zastoupení mikrosatelitů. Studovali jsme distribuci všech možných mono-, di- a tri-nukleotidů na chromozomech Silene latifolia. Měření intenzity signálu ukázalo, že většina těchto mikrosatelitů se akumuluje na chromozomu Y. Akumulace mikrosatelitů je navíc silnější na raménku q, které nese pseudoautozomální oblast PAR a přestalo rekombinovat později než raménko p, jež přestalo rekombinovat již v časných fázích evoluce chromozomu Y. Na základě těchto výsledků je možné hovořit o akumulaci mikrosatelitů, které následuje expanze velikosti genomu. Za šířením mikrosatelitů může stát několik mechanizmů, prokluzování při replikaci (replication slippage) nebo procesy na bázi rekombinace, nerovnoměrný crossing over či genová konverze. Nejasná je role mikrosatelitů v evoluci pohlavních chromozomů. Například d(GAA)n tvoří rekombinační hot spoty, místa s vyšší mírou rekombinace. Dlouhé úseky těchto repeticí mohou tvořit DNA non-B konformace, tak zvanou „lepivou DNA“ která může dostávat do kontaktu vzdálené úseky téhož řetězce DNA a poskytovat tak prostor dalším mechanizmům jako například genové konverzi.

Abstract:

Abstract – Study of repetitive sequences on the Y chromosome of Silene latifolia Evolution of sex chromosomes is one of basic questions in evolutionary biology. While mammalian sex chromosomes are evolutionary old (nearly 300 milions of years), we can find many examples of sex chromosomes in various stages of evolution among plant sex chromosomes. Silene latifolia is a model dioecious plant with heteromorphic sex chromosomes which are 10-20 milions of years old. The Y chromosome is the largest chromosome in this species, it is 40 % larger than the X chromosome. It is generally accepted that the evolution of structurally distinct sex chromosomes from a pair of autosomes involves a stepwise restriction of recombination between proto-Y and proto-X chromosomes. Genomic regions of the Y with little or no recombination are subject to several processes leading to degeneration of Y chromosome, loss of many functionally important genes or accumulation of repetitive DNA sequences. Accumulation of repetitive sequences is proposed to be the main factor that influence the size of Y chromosome. In this work we study sequences on the Y chromosome of Silene latifolia, that may cause its growing and that accumulate more intensively on the Y chromosome compared to the X and autosomes. We focused on three types of sequences: promiscuous DNA, mobile elements and tandem repeats. Promiscuous DNA is DNA of organelle origin transferred to the nucleus. Although the transport of organelle DNA to the nucleus is common and well known as the endosymbiotic gene transfer, there has been the question whether organelle DNA is integrated into preferred chromosomes, chromosome regions, or sequence contexts. We isolated a BAC clone containing chloroplast DNA. This BAC clone hybridized 3,3 times more intensively to the Y chromosome of Silene latifolia than to the other chromosomes, indicating that the chloroplast sequences have accumulated on the Y chromosome and also may contribute to its large size. We constructed X- and Y-specific libraries to analyse divergence of X- and Y-linked chloroplast DNA. Our results showed very low divergence of genic chloroplast sequences located in the nucleus to the chloroplast genome. It indicates the recent transfer of chloroplast DNA to the nucleus in Silene latifolia and probably a high turnover of organelle sequences in the nucleus. Mobile elements are genetic parasites of both eukaryots and prokaryots. They spread within the genome of their host, they can damage hosts genes and increase the size of genome. LTR retrotransposons are a class of mobile elements with duplicative mode of transposition via RNA intermediate. We described a pair of novel Ty3/gypsy retrotransposons of Silene latifolia, consisting of a non-autonomous element Retand-1 (3,7 kb) and its autonomous partner Retand-2 (11,1 kb). These two elements have highly similar long terminal repeats (LTRs) but differ in the presence of the typical retroelement coding regions (gag-pol genes), most of which are missing in Retand-1. Retand elements are higly abundant in Silene latifolia genome, there is similar number of autonomous Retand-2 copies (2700) as non-autonomous Retand-1 copies (2100). Retand is also present in other Silene species. Autonomous Retand-2 contains two additional open reading frames of unknown function in antisense orientation on the 3’ end. Retand is constitutively transcribed in all organs tested (leaves, flower buds and roots). High sequence similarity of LTRs in individual elements indicates their recent transpositional activity. An interesting feature of the Retand is the presence of a tandem repeat sequence STR1 (Silene Tandem Repeat) more amplified in the non-autonomous Retand-1. We speculate that retroelements may play a role in spreading of tandem repeats within genomes. We analysed LTRs of Retand that were amplified from laser microdissected X and Y chromosomes and autosomes of Silene latifolia. In phylogenetic analysis a majority of X-

Abstract:

and Y-derived LTRs formed a few separate clades reflecting their high intrachromosomal similarity. Moreover, the LTRs localized on the Y chromsome were less divergent than the X chromosome-derived or autosomal LTRs. These data can be explained by a homogenization process, such as gene conversion, working more intensively on the non-recombining Y chromosome. Another type of DNA sequences we have studied were tandem repeats, namely microsatellites. Microsatellites are ubiquitous class of simple repetitive, rapidly evolving DNA sequences in eukaryotic genomes. They are supposed to be the early colonizers of genomic regions, where recombination restriction occured. Because recombination restriction on the Y chromosome of Silene latifolia is a gradual process, there is a possibility to find regions with different abundance of microsatellites. We studied the chromosomal distribution of various microsatellites represented by all possible mono-, di- and trinucleotides. Our results demonstrate that a majority of microsatellites is accumulated on the q-arm of the Y chromosome. This chromosome stopped recombining recently, and has had less time to accumulate repetitive DNA sequences compared to the p-arm. Based on these facts we can speculate that microsatellites have accumulated in regions which pre-date the genome expansion. Spreading of microsatellites can be caused by several procesess: e.g. replication slippage, mechanisms on the basis of recombination such as unequal crossing over or gene conversion. It is also possible that microsatellites have played an important role in sex chromosome evolution in their relation to non-B DNA conformations and recombination. Long tracts of d(GAA)n sequences have been recognized as recombination hot spots, they form a special conformation of DNA called “sticky DNA”, that can bring two distant regions located on the same chromosome into contact and thus help gene conversion to act on them, especially in newly X-Y diverging regions.

Keywords

pohlavní chromozom, repetice, retrotranspozon, mikrosatelit sex chromosome, repeats, retrotransposon, microsatellite, Silene

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 12. 2007

Thesis defence

• Date of defence: 10. 12. 2007
• Supervisor: doc. RNDr. Eduard Kejnovský, CSc.
• Reader: prof. RNDr. Jiří Rubeš, CSc., prof. RNDr. František Marec, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / General and Molecular Genetics