Response of keratinocytes to UV radiation and its modulation by hyaluronan

Mgr. Martina Moravcová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Lidská kůže je neustále vystavována ultrafialovému (UV) zářením, které zprostředkovává komplexní biologickou odpověď, která zahrnuje vývoj erytému, edém, tvorbu apoptických buněk, hyperplasii buněk, potlačení imunity a melanogenezi. Tyto procesy mohou vyvolat řadu patologických procesů, jako jsou fotostárnutí a vznik rakoviny kůže. Jednou z možností jak chránit lidskou kůži před škodlivými účinky UV záření je použití fotoprotektivních látek. V uplynulých letech, přirozeně se vyskytující látky získaly značnou pozornost jako potenciální protektivní látky. Hlavním cílem této práce bylo otestovat potenciál hyaluronanu (HA) a extraktu z Epilobium angustifolium (EA) při ochraně lidské kůže před UV zářením za použití nově optimalizovaných komplexních in vitro a in vivo metodologických přístupů. Proto byly především vytvořeny komplexní modely charakterizující odezvu lidských keratinocytů a fibroblastů na UV záření. Reakce UV ozářených keratinocytů potvrzují všeobecně uváděné účinky, včetně indukce genové exprese c-Jun a matrix metalloproteinázy (MMP) a produkci prozánětlivých mediátorů. Kromě toho bylo zjištěno, že akutní UV záření moduluje genovou expresi keratinů a involucrinu v závislosti na čase po ozáření. Navíc byla pozorována u modelu předčasně zestárlých fibroblastů vyvolané stresem a opakovaně UV ozářených fibroblastů indukce fibronektinu (FN), růstového faktoru tkáňového pojiva (CTGF), MMPs, hyaluronidáz (HYALs) a tkáňových inhibitorů metalloproteináz (TIMPs). Jeden z vybraných látek testovaných na ochranné účinky u UV ozářených buněk byl HA. HA jako přirozeně se vyskytující součást extracelulární matrix, nijak významně nemoduluje UV-indukované snížení v genové expresi receptorů HA (CD44, toll-like receptor (TLR) 2), a enzymy zapojené do metabolismu HA zahrnující hyaluronan syntázu (HAS)-2 a HYAL-2. Genová exprese ostatních HA receptorů, včetně TLR-4 a receptoru pro HA-zprostředkovanou buněčnou motilitu, nebyly zjištěny ani v kontrole ani u HA ovlivněných buněk. Stejně tak exprese HAS-3 a HYAL-3 nebyly významně modulované UV zářením a HA. Na druhé straně, HA významně potlačil UV-indukovanou produkci pro-zánětlivých mediátorů, jako jsou interleukin-6, interleukin-8, transformující růstový faktor β1 a dále také produkci rozpustného CD44. Nakonec, HA částečně, ale významně potlačil UV-indukovaný pokles buněčné viability. Další látkou testovanou pro své ochranné účinky u UV ozářených buněk byl extrakt z EA. Komplexní analýza EA extraktu identifikovala tři hlavní polyfenolické látky, kterými jsou taniny (oenothein B), fenolické kyseliny (gallová a chlorogenová kyselina) a flavonoidy. Všechny z nich jsou dobře popsány pro schopnost vychytávat volné radikály. Použití extraktu z EA u UV ozářených fibroblastů zabraňuje UV-indukovanému poškození dermis tím, že inhibuje indukci TIMPs, MMPs a HYAL v buněk modelu fotostárnutí. Snížení CTGF a FN po ovlivnění EA extraktem byla zjištěna u předčasně zestárlých fibroblastů. Navrhované ochranné mechanismy mohou také zahrnovat schopnost extraktu EA modulovat sirtuin-1. Aplikace EA extraktu ochraňuje kůži proti UV-indukované tvorbě erytému in vivo. Lze uzavřít, že vyvinuté a charakterizované in vitro experimentální přístupy pro testování fotoprotektivních účinků látek byly úspěšně použity pro charakterizaci ochranných účinků HA a EA extraktu proti negativním účinkům UV záření. Tento model může být použit pro budoucí výzkum, kde zavedení nových preventivních a terapeutických strategií závisí na pochopení molekulárního mechanismu UV-indukovaných patologických změn v buňkách. HA a extrakt z EA se ukázaly jako slibní kandidáti pro ochranu nepřízniv

Abstract:

ých účinků UV záření na kůži.

Abstract:

Human skin is constantly exposed to the ultraviolet (UV) irradiation that mediates a complex biological response that includes development of erythema, edema, sunburn cell formation, cell hyperpla¬sia, immune suppression, and melanogenesis. These processes can induce a number of pathological processes such as photoaging and skin cancer development. One approach how to protect human skin against the harmful effects of UV irradiation is to use photoprotective substances. In recent years, naturally occurring compounds have gained considerable attention as potential protective agents. The main aims of this thesis were to test the potential of hyaluronan (HA) and extract from Epilobium angustifolium (EA) to protect human skin against UV irradiation employing newly optimized complex in vitro and in vivo methodological approaches. Thus, primarily, comprehensive models characterizing response of human keratinocytes and fibroblast to UV radiation were established. The response of UV irradiated keratinocytes confirmed generally reported effects including induction of c-Jun and matrix metalloproteinase (MMP) gene expression and production of pro-inflammatory mediators. Additionally, it was found that acute UV radiation modulates keratin and involucrin gene expression depending on time after radiation. Moreover, induction of fibronectin (FN), connective tissue growth factor (CTGF), MMPs, hyaluronidases (HYALs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) were observed in stress-induced premature senescent fibroblast model and repeatedly UV irradiated fibroblasts. One of the selected compounds tested for its protective effects on UV irradiated cells was HA. HA, naturally occurring component of extracellular matrix, did not significantly modulate UV-induced decrease in the gene expression of HA receptors (CD44, toll-like receptor (TLR) 2) and the enzymes involved in HA metabolism including hyaluronan synthase (HAS)-2 and HYAL-2. The expressions of other HA receptors, including TLR-4 and the receptor for HA-mediated motility, were not detected in either the control or HA-treated cells. Similarly, the expressions of HAS-3 and HYAL-3 were not significantly modulated by UV irradiation and HA treatment. On the other hand, HA significantly suppressed UV-induced release of pro-inflammatory mediators such as interleukin-6 and interleukin-8, transforming growth factor β1 and also soluble CD44 release. Finally, HA partially, but significantly, suppressed the UV-induced decrease in cell viability. Other compound tested for its protective effects on UV irradiated cells was extracted from EA. The complex analysis of the EA extract identified three major polyphenolic substances, which were tannins (oenothein B), phenolic acids (gallic and chlorogenic acids) and flavonoids. All of these are well described as free radical scavengers. The application of EA extract on irradiated fibroblasts prevented UV-induced dermal damage by inhibiting the induction of MMPs, TIMPs and HYAL in photoaged cell model. The reduction in CTGF and FN after EA extract treatment was detected in premature senescent fibroblast. The proposed protective mechanisms could also include the ability of EA extract to modulate sirtuin-1. Finally, the application of EA extract protected skin against UV-induced erythema formation in vivo. It can be concluded, that the developed and characterized in vitro experimental approaches for testing of photoprotective effects of substances were successfully employed for the characterization of protective effects of HA and EA extract against negative effects of UV radiation. The model will be used for further research since the introduction of novel preventive and therapeutic strategies depends on our understanding of the molecular mechanism of UV-mediated pathological changes in cells. HA and extract from EA were shown to be promising candidates for protection of the adverse effects of UV radiation on the skin.

Keywords

Epilobium augustifolium, Extracellular matrix, Fibroblast, Hyaluronan, Keratin, Keratinocyte, Photoaging, Skin, Ultraviolet radiation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 8. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 19. 9. 2013
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Antonín Lojek, CSc., doc. PharmDr. Petr Nachtigal, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology