Studium signálních MAPK drah a oxidativního stresu u vojtěšky

Mgr. Jiří SOJKA

Disertační práce

Study of MAPK signaling pathways and oxidative stress in alfalfa

Abstract:

Mitogenem aktivované protein kinasové (MAPK) kaskády jsou evolučně konzervované signální dráhy v eukaryotických buňkách. Podílejí se na signalizaci širokého spektra buněčných procesů. Jsou zodpovědné za intracelulární přenos signálů, které jsou rozpoznávány na periferii buňky. MAPK se podílejí na signalizaci biotického a abiotického stresu. Kromě toho se také podílejí na růstu a vývoji rostlin, stejně jako na interakcích rostlin s patogeny a symbiotickými mikroorganismy. Sekundární poslové, mezi které patří reaktivní formy kyslíku (RFK), také přispívají k aktivitě MAPK. Při fyziologických koncentracích se RFK podílejí na aktivaci signálních drah a komunikaci mezi buňkami a intracelulárními organelami. Během stresu se hladiny RFK často zvyšují a mohou se hromadit natolik, že způsobují oxidativní stres. Oxidativní stres je nebezpečný, protože může degradovat biomolekuly potřebné pro správnou funkci buněk. V důsledku toho si rostliny vyvinuly složitý antioxidační systém a MAPK hrají důležitou roli v řízení obranných mechanismů. Takové obranné mechanismy proti zvýšeným hladinám RFK se vyvinuly také u vojtěšky seté (Medicago sativa). Jedním z cílů této studie bylo objasnit roli STRESEM INDUKOVANÉ MAPK (SIMK) v závislosti na její aktivitě a množství v celkové antioxidační obraně vojtěšky. V tomto ohledu byly použity rostliny divokého typu Regen SY a linie se sníženou expresí SIMKK a SIMK (SIMKK RNAi) a nadměrnou expresí GFP-SIMK. Biochemické, proteomické a mikroskopické analýzy ukázaly, že zvýšené množství SIMK mělo významný vliv na aktivitu a množství důležitých antioxidačních enzymů. Linie s nadměrným množstvím a nadměrnou aktivací fúzního proteinu GFP-SIMK nejúčinněji degradovala přebytek RFK. Tato linie byla odolnější vůči dlouhodobému menadionem-indukovanému oxidativnímu stresu než rostliny divokého typu a náchylné linie SIMKK RNAi. Antioxidační obrana byla z velké části založena na množství a aktivitě glutathion S-transferas. Tyto hojně se vyskytující antioxidační enzymy se podílejí na degradaci RFK. Kromě toho byly pomocí diferenciální proteomické analýzy popsány změny v množství proteinů regulujících metabolismus, cytoskelet, mitochondrie a chloroplasty, což zvýrazňuje celkový účinek menadionu na transgenní linie vojtěšky. Druhá část práce je věnována přípravě transgenní linie vojtěšky s nadměrnou expresí STRESEM AKTIVOVANÉ MAPK (SAMK). SAMK může hrát důležitou roli v odolnosti vojtěšky vůči různým typům stresu. Kinasy ortologní k SAMK z jiných rostlinných druhů se podílejí na signalizaci oxidativního stresu. Proto je příprava této linie pro studium signálních drah ve vojtěšce zásadní. Fúzní konstrukty SAMK s GFP byly klonovány pod kontrolu konstitutivního promotoru 35S a byly připraveny stabilní transgenní linie vojtěšky. Tyto linie byly ověřeny na přítomnost fúzního proteinu pomocí molekulárních, biochemických a mikroskopických metod. Kromě toho byly provedeny analýzy k určení, zda nadměrná exprese GFP-SAMK v kombinaci s nadměrnou expresí nadřazených kinas SIMKK a PRKK může způsobit programovanou buněčnou smrt nebo jiné defekty. Interakce SIMKK a PATOGEN-RESPONSIVNÍ MAPKK (PRKK) se SIMK, SAMK, MEDICAGO MAPK2 (MMK2) a MEDICAGO MAPK3 (MMK3) byla potvrzena pomocí rekombinantních proteinů. Pomocí přechodné kotransformace listů Nicotiana benthamiana a následných analýz bylo zjištěno, že koexprese SIMKK se SIMK nebo SAMK, a méně s MMK2 nebo MMK3, může způsobit programovanou buněčnou smrt v listech N. benthamiana, zatímco kombinace všech čtyř MAPK s PRKK ji tlumily. Tato práce částečně objasňuje roli vybraných členů MAPK kaskád, které jsou úzce spjaty s antioxidačním aparátem vojtěšky. Získané exp

Abstract:

Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades are evolutionarily conserved signaling pathways in eukaryotic cells. They are involved in signaling of a wide range of cellular processes. They are responsible for the intracellular transmission of signals recognized on the cell periphery. MAPKs are involved in biotic and abiotic stress signaling. Along with this, they are also involved in plant growth and development, as well as plant interactions with pathogens and symbiotic microorganisms. Secondary messengers, which include reactive oxygen species (ROS), also contribute to MAPK activity. At physiological concentrations, ROS are involved in activating signaling pathways and communication between cells and intracellular organelles. During stress, ROS levels often increase, and they can accumulate to such an extent that cause oxidative stress. Oxidative stress is dangerous because it can degrade biomolecules required for proper cell function. As a result, plants have developed an elaborate antioxidant system, and MAPKs play an important role in controlling defense mechanisms. Such defense mechanisms against elevated levels of ROS have also evolved in alfalfa (Medicago sativa). One objective of this study was to elucidate the role of STRESS-INDUCED MAPK (SIMK), depending on its activity and abundance, in the overall antioxidant defense of alfalfa. In this respect, wild-type Regen SY plants and lines with reduced expression of SIMKK and SIMK (SIMKK RNAi) and overexpression of GFP-SIMK were used. Biochemical, proteomic, and microscopic analyses showed that increased SIMK abundance conferred a major effect on the activity and abundance of important antioxidant enzymes. The line with overabundant and overactivated GFP-SIMK fusion protein degraded most effectively an excess of ROS. In the long term, this line was more resistant to menadione-induced oxidative stress than the wild-type plant and susceptible SIMKK RNAi line. Such antioxidant defense was largely based on the abundance and activity of glutathione S-transferase. These abundant antioxidant enzymes are involved in ROS degradation. In addition, changes in the abundance of proteins regulating metabolism, cytoskeleton, mitochondria, and chloroplasts were described by differential proteomic analysis, highlighting the overall effect of menadione on transgenic alfalfa lines. The second part of the work is devoted to the preparation of an alfalfa transgenic line with overexpressed STRESS-ACTIVATED MAPK (SAMK). SAMK may play an essential role in the resistance of alfalfa to different types of stress. Kinases orthologous to SAMK from other plant species are involved in oxidative stress signaling. Therefore, the importance of preparing such a line to study signaling pathways in alfalfa is pivotal. SAMK fusion constructs with GFP were cloned under the control of a constitutive 35S promoter, and stably transformed alfalfa lines were prepared. These lines were verified for the presence of the fusion protein using molecular, biochemical, and microscopic methods. In addition, analyses were performed to determine whether overexpression of GFP-SAMK combined with overexpression of upstream kinases SIMKK and PRKK could cause programmed cell death or other defects. The interaction of SIMKK and PATHOGEN-RESPONSIVE MAPKK (PRKK) with SIMK, SAMK, MEDICAGO MAPK2 (MMK2) and MEDICAGO MAPK3 (MMK3) was confirmed using recombinant proteins. By transient cotransformation of Nicotiana benthamiana leaves and subsequent analyses, it was found that coexpression of SIMKK with SIMK or SAMK and less with MMK2 or MMK3 can cause programmed cell death in N. benthamiana leaves, whereas combinations of all four MAPKs with PRKK attenuated it. This work partially elucidates the role of selected members of MAPK cascades, closely related to alfalfa antioxidant machinery. Obtained experimental findings might contribute to direct biotechnological applications in agriculture and provide a good basis for further research.

Abstract:

erimentální výsledky mohou přispět k přímým biotechnologickým aplikacím v zemědělství a poskytnout dobrý základ pro další výzkum.

Keywords

Medicago sativa, MAPK, SIMK, SAMK, oxidativní stres, menadion, programovaná buněčná smrt

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 27. 9. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. RNDr. Jozef Šamaj, DrSc.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie