Detekce fragmentů DNA při poškození buněk

Bc. Věra Brychtová

Master's thesis

Detection of DNA fragmentation after cell damage

Abstract:

Tato práce se zaměřuje na detailní popis procesu apoptózy a poskytuje teoretický přehled metod pro detekci apoptózy. Největší pozornost je věnována metodě TUNEL. V dnešní době patří TUNEL metoda mezi nejvíce používané metody pro detekci apoptózy. Cílem naší práce bylo optimalizovat použití TUNEL metody na vybrané buněčné linii, aplikovat optimalizovanou metodu na buněčné linii ovlivněné dvěma toxiny a na závěr práce použít komerční metodu TUNEL na stejné buněčné linii a porovnat ji s optimalizovanou metodou pomocí fluorescenční mikroskopie. V první části naší práce jsme optimalizovali jednotlivé kroky metodiky TUNEL na renální linii HK-2. Nejprve jsme se zaměřili na optimalizaci fixace buněk. Jako optimální jsme pro fixaci buněk vybrali použití 9,8% formaldehydu. Následně jsme prováděli permeabilizaci buněk Tritonem X-100 a jako nejvhodnější jsme určili použití 0,5% Tritonu X-100. V dalším kroku jsme optimalizovali inkorporaci bromdeoxyuridinu (BrdU) na zlomy DNA terminální deoxynukleotidyltransferázou a zhodnotili jsme, že nepříhodnější je použití BrdU (0,01 uM) a aplikace 4x ředěného enzymu. Dále jsme optimalizovali denaturaci DNA a blokování nespecifických míst, kdy jsme nalezli, že optimální je použití 2 M kyseliny chlorovodíkové a použití 1% hovězího sérového albuminu. V posledním kroku jsme optimalizovali navázání anti-BrdU protilátek na BrdU a jako nejvhodnější jsme vybrali ředění protilátek 1:2000. Při aplikaci optimalizované metody na HK-2 buňkách byl z fluorescenčních snímků patrný pozitivní signál fluorescence při ovlivnění buněk cisplatinou (25 uM, 50 uM) po době inkubace 16 a 20 hodin a kamptotecinem (2 uM, 10 uM) po době 24 a 48 hodin. Po použití komerční metody TUNEL na HK-2 buňkách ovlivněných cisplatinou (50 uM; 48 hodin) jsme z fluorescenčních snímků zhodnotili, že komerční metoda je senzitivnější než námi optimalizovaná metoda.

Abstract:

This thesis is focused on a detailed description of the apoptosis process and provides an overview of methods for detection of apoptosis. The greatest attention has been paid to the TUNEL assay. Presently, TUNEL assay has been one of the most commonly used methods for detection of apoptosis. The aim of our thesis was to optimize the use of the TUNEL assay in a selected cell line, to apply the optimized method in the cell line treated with two toxins. Finally, we aimed to use the commercial TUNEL assay in the same cell line and to compare it with the optimized method. In our thesis, we optimized the individual steps of the TUNEL assay procedure in renal line HK-2. Firstly, we focused on optimizing cell fixation. As optimal, we chose 9.8% formaldehyde for cell fixation. Subsequently, we performed cell permeabilization by Triton X-100 and we chose the use of 0.5% Triton X-100 as optimal. In the next step, we optimized the incorporation of bromdeoxyuridine (BrdU) to DNA strand breaks using the terminal deoxynucleotidyl transferase. The most suitable application of BrdU was 0.01 uM and the application of TdT diluted four times. We also optimized DNA denaturation and blocking of nonspecific interaction. We found the use of 2 M hydrochloric acid and 1% bovine serum albumin as optimal. Finally, we optimized the binding of anti BrdU antibodies and we chose the 1: 2000 dilutions as the most suitable. When using the optimized method in HK-2 cells, the fluorescence positive signal was visible for cells treated with cisplatin (25 uM, 50 uM) for 16 and 20 hours and cells treated with camptothecin (2 uM, 10 uM) for 24 and 48 hours. Finally, after use of commercial TUNEL assay in HK-2 cells treated with cisplatin (50 uM; 48 hours), we found that the commercial method is much more sensitive than the optimized method.

Keywords

Apoptóza, fragmentace DNA, bromdeoxyuridin, terminální deoxynukleotidyltranseferáza, fluorescence.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 5. 2018

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Supervisor: doc. RNDr. Tomáš Roušar, Ph.D.

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Master programme / field:
Special Chemical and Biological Programmes / Bioanalyst