Příprava a charakterizace rekombinantních glykoproteinů produkovaných v prokaryotních buňkách

Bc. Hana DOSTÁLOVÁ

Diplomová práce

Preparation and characterization of recombinant glycoproteins produced in prokaryotic cells

Anotace:

Rekombinantní proteiny nacházejí široké uplatnění v medicínské sféře, kde jsou základem léčby mnoha onemocnění. Díky rozvoji technologie rekombinantní DNA, proteinového inženýrství a biotechnologií lze lidské proteiny připravovat in vitro. Nejvyužívanějšími systémy pro jejich produkci jsou bakterie, kvasinky, hmyzí a savčí buňky. Díky genetickému inženýrství lze vlastnosti proteinu dále upravovat a zlepšovat, s využitím afinitních značek potom usnadňovat jejich purifikaci z buněčného lyzátu. Až 50 % biologicky aktivních proteinů se nachází v glykosylované formě. Tato posttranslační modifikace probíhá v endoplasmatickém retikulu a Golgiho aparátu a zahrnuje řadu enzymatických kroků. Glykoproteiny plní v organismu velkou škálu funkcí včetně imunitních. Jednou z imunologicky významných skupin jsou imunoglobuliny. Správná a funkční glykosylační dráha je klíčová pro správný chod fyziologických procesů v buňce i v celém organismu. Imunoglobulin A (IgA) představuje významný faktor slizniční ale i systémové imunity. Defekt v glykosylaci IgA1 je jedním z faktorů vzniku a rozvoje chronického onemocnění ledvin IgA nefropatie. IgA1 deficientní v množství připojené galaktosy (Gd-IgA) je rozlišováno vznikajícími autoprotilátkami třídy zejména IgG za vzniku vysokomolekulárních imunokomplexů. Ty se ukládají v mesangiu ledvin, kde aktivují zánětlivou reakci. Nemoc může vést až k selhání ledvin. Jedna z cest vývoje kauzální léčby je založena na aplikaci rekombinantních glykoproteinů odvozených od IgA, které budou kompetovat s Gd-IgA1 o vazbu autoprotilátek bez vzniku patogenních imunomomplexů. Jedná se o rekombinantní glykoproteiny o menší molekulové hmotnosti než patologické Gd-IgA1. V rámci diplomové práce byly připraveny rekombinantní glykoproteiny IgA1 CH1-P-CH2 a samostatný těžký řetězec IgA1. Ty budou v dalším výzkumu použity pro studium jejich schopnosti inhibovat tvorbu patogenních imunitních komplexů typických pro IgA nefropatii.

Abstract:

Recombinant proteins are widely used in medicine, and they are the basis for the treatment of many diseases. As a result of the advances of recombinant DNA technology, protein engineering and biotechnologies, human proteins can be prepared in vitro. The most common express systems are bacteria, yeasts, instect and mammalian cells. Thanks to genetic engineering, protein characteristics can be further modified and improved, and furthermore, using affinity tags we can facilitate their purification. Up to 50 % biologically active proteins can be found in their glycosylated form. This post-translation modification takes place in endoplasmic reticulum and Golgi apparatus, and incules a number of enzymatic steps. Glycoproteins have various functions in organism, including immunological function. Immunoglobulins are one of immunologically important groups of glycoproteins. Correct and functional glycosylation is key to proper functioning physiological processes in cells and whole organism. Immunoglobulin A presents a significant factor in both mucosal and systemic immunity. Defects in glycosylation of immunoglobulin A1 (IgA1) is one of the main factors contributing to initiation and progression of IgA nephropathy, a chronic kidney disease. IgA1, which is deficient in number of added molecules of galactose (Gd-IgA1), is recognized by emerging autoantibodies, especially those of IgG isotype, which results in formation of high molecular weigh immunocomplexes. These complexes are deposited in the renal mesangium and trigger inflammatory reactions. The disease can lead to renal failure. One way leading to the development of causal therapy is based on the use of recombinant IgA-derived glycoproteins that will compete with Gd-IgA1 to bind autoantibodies without the formation of pathogenic immunomplexespatologival Gd-IgA1. In the experimental part of this Master's thesis recombinant glycoproteins CH1-P-CH2 and IgA1 heavy chain were prepared. These proteins can be used in further studies to investigate their inhibitory effect on formation of pathological immunocomplexes typical for IgA nephropaty.

Klíčová slova

Glykoproteiny, IgA1, IgA nefropatie, rekombinantní proteiny

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 27. 4. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie