Vliv elicitinů na změny proteomu tabáku

Bc. Ladislav Dokládal, Ph.D.

Master's thesis

Elicitins impact on the proteome of tobacco

Anotácia:

Kryptogein je vysoce účinný elicitin produkovaný oomycetou Phytophthora cryptogea. V minulosti byla popsána percepce kryptogeinu buňkami tabáku a navrženy některé kroky následné signální dráhy. Tato diplomová práce se zaměřuje zejména na studium vztahu mezi interakcí elicitin-lipid a průběhem obranné reakce rostliny. Byly připraveny a testovány tři nové rekombinantní mutantní kryptogeiny: L41F (alterace vazby mastných kyselin), V84F (alterace vazby sterolů) a L41F/V84F (alterace vazby mastných kyselin i sterolů). Byl zkoumán jejich vliv na expresi proteinů, syntézu fytoalexinu kapsidiolu a rozsah hypersenzitivní reakce. Byly testovány i dříve připravené wild type a L19R rekombinantní kryptogeiny. Proteomický experiment byl navržen tak, že bylo dosaženo dobrého kompromisu mezi spotřebou rostlinného a jiného materiálu a kvalitou separace. Majorita identifikovaných proteinů se přirozeně nachází extracelulárně, což dohromady s výsledky stanovení kyseliny chlorogenové ukazuje na dobrou kvalitu izolace apoplastické tekutiny. MS identifikace vybraných spotů prokázala, že téměř všechny identifikované proteiny hrají roli v obraně rostliny: β-1,3-glukanasy, chitinasy, inhibitory proteinas, peroxidasy, germin-like protein, NtPRp27, cyclophilin-like protein. Význam identifikovaných proteinů při interakci rostlina-patogen a závislost jejich exprese na schopnosti elicitinů vázat lipidické látky jsou v práci dále diskutovány. Rozsah hypersenzitivní reakce po napadení tabákových listů jednotlivými mutanty kryptogeinu koreluje s produkcí fytoalexinu kapsidiolu, s velkou pravděpodobností proto, že oba děje jsou závislé na hladině peroxidu vodíku. Aplikace kryptogeinů nesoucích mutaci L41F nevyvolala v listech tabáku ani významnou hypersenzitivní odpověď, ani signifikantní syntézu kapsidiolu. Získané výsledky naznačují, že význam interakce mezi elicitiny a mastnými kyselinami má mnohem větší význam, než se dříve očekávalo.

Abstract:

Cryptogein is a very efficient elicitin from Phytophthora cryptogea. Perception of cryptogein in tobacco cells was described and some steps of signaling pathway elucidated. This thesis focuses particularly on the study of relationship between elicitin-lipid interaction and plant defense reaction course. In this work, three new recombinant cryptogein mutants were prepared and tested: L41F (altered fatty acids binding), V84F (altered sterols binding), and L41F/V84F (altered both fatty acids and sterols binding). Their effects on protein expression, phytoalexin capsidiol synthesis, and hypersensitive response extent were tested. Effects of wild-type and L19R recombinant cryptogeins, that were prepared previously, were tested too. The proteomic experiment was designed so that a good compromise between plant and other material consumption and separation quality was found. The majority of identified proteins are naturally located extracellularly, which together with chlorogenic acid analysis results shows a good quality of apoplastic fluid isolation. MS identification of selected spots proved that almost all the proteins identified play role in plant defense: β-1,3-glucanases, chitinases, proteinase inhibitors, peroxidases, germin-like protein, NtPRp27, cyclophilin-like protein. The role of the identified proteins in plant-pathogen interaction and the dependence of their expression on elicitins’ abilities to bind lipid compounds are discussed. The extent of the hypersensitive response after tobacco leaves treatment with particular cryptogein mutants correlates with phytoalexin capsidiol production, most probably because both events are dependent on hydrogen peroxide level. Treatment with cryptogeins possessing L41F mutation triggered neither significant hypersensitive response nor significant capsidiol synthesis in tobacco leaves. The results indicate that the interaction between elicitins and fatty acids is of much greater importance than expected before.

Keywords

elicitor, elicitin, cryptogein, PR proteins, phytoalexin, capsidiol, hypersensitive response, site directed mutagenesis, 2-D electrophoresis, Pichia pastoris

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 4. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 10. 6. 2010
• Vedúci: doc. Mgr. Jan Lochman, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry