Možnosti využití elektrochemických detekčních systémů v separačních technikách

Mgr. Zdenka BARTOŠOVÁ

Doctoral thesis

Electrochemical Detection Systems and Their Use in Separation Techniques

Abstract:

Předkládaná disertační práce se zaměřuje na dvě oblasti amperometrické detekce ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC), a to na využití borem dopované diamantové elektrody (BDD) a mikroelektrod z uhlíkového vlákna (CFME). Jak BDD tak CFME se vyznačují pozoruhodnými vlastnostmi, které tyto elektrody značně odlišují od ostatních elektrodových materiálů a konstrukcí. Výhod spojení BDD s HPLC bylo využito při vývoji citlivé metodiky vhodné ke stanovení léčiv erektilní dysfunkce a pulmonární hypertenze, sildenafilu (Viagra) a vardenafilu (Levitra), včetně jejich hlavních aktivních metabolitů N-desmethylsildenafilu a N desethylvardenafilu v krevní plasmě. Z hlediska chromatografie bylo optimalizováno zejména složení pufru, jeho koncentrace a pH. Výsledkem byla dokonalá a rychlá separace (12 minut) všech analytů na krátké narrow-bore koloně s vázanou C18 fází bez nutnosti použití gradientové eluce. Detekce analytů je založena na jejich oxidaci na BDD elektrodě při potenciálu +1520 mV (vs. Pd/H2). Odezva byla dobře reprodukovatelná a lineární v rozsahu koncentrací 10-400 ng ml-1 a LOQ pro jednotlivé analyty se pohybuje na úrovni 10 ng ml-1. Metoda vyžaduje pouze malé množství vzorku (150 ul krevní plasmy), což může být přínosné v případě omezeného množství biologického materiálu. Metodika byla ověřena při analýze krevní plasmy s přídavkem zmíněných analytů na terapeutických koncentračních hladinách. Vyvinutá metoda může najít uplatnění při terapeutickém monitoringu nebo ve forenzní analýze, a při vhodné úpravě vzorku také při kontrole kvality léčiv nelicencovaných distributorů. Klíčové vlastnosti elektrod jsou dány nejen použitým materiálem, ale také tvarem a velikostí, jak je evidentní u systémů na bázi mikroelektrod. Druhá část této disertační práce je zaměřena na využití mikroelektrod z uhlíkového vlákna (CFME) jako citlivých senzorů ve vysokoúčinné kapalinové chromatografii. Základní analytické charakteristiky detekčního systému na bázi CFME byly testovány na analýze modelové směsi vybraných fenolických kyselin (gallová, protokatechová, gentisová, 4 hydroxybenzoová a kávová), a rovněž při vývoji HPLC metody stanovení vybraných bromovaných fenolů (4-bromofenol, 2,4-dibromofenol, 2,6-dibromofenol, 2,4,6-tri-bromofenol a 3,3',5,5'-tetrabromobisfenol A).Elektrochemický CFME detektor byl dále úspěšně otestován při analýze významného markeru oxidativního poškození DNA, 8-oxo-7,8-dihydro-2´-deoxyguanosinu (8 oxodGuo). Citlivost a selektivita metody byla ověřena na reálných vzorcích krevní plasmy pacientů s karcinomem prostaty. Dosažené výsledky ukazují, že analytické vlastnosti CFME senzorů v tomto uspořádání mohou být dobře využitelné pro rutinní sledování hladin 8-oxodG v tělních tekutinách. Jako značně perspektivní se jeví možnost změny selektivity CFME díky modifikaci jejich povrchu, například nanostrukturovanými vrstvami kovů. Příkladem analytické aplikace, využívající CFME modifikovanou elektrolyticky deponovanou vrstvou mědi (Cu-CFME), je stanovení vybraných sacharidů pomocí HPLC s elektrochemickou detekcí za konstantního potenciálu. 58 pmol laktózy, sacharózy a maltózy ("on-column") bylo detekováno na Cu-CFME při +500 mV (vs. Ag/AgCl) po jejich předchozí HPLC separaci v silně alkalickém prostředí. Zajímavé analytické možnosti do budoucnosti nabízí modifikace CFME také dalšími kovy. Výše uvedené příklady dokumentují mimořádné analytické vlastnosti studovaných amperometrických detekčních systémů v kombinaci s HPLC. BDD elektrody se uplatní zejména při analýze obtížně oxidovatelných látek nebo v případech, kdy může docházet k pasivaci elektrodového povrchu. Hlavní předností CFME kromě mimořádné citlivost

Abstract:

i je možnost modifikace povrchu mikroelektrod za účelem změny selektivity či jejich implementace do kapilárních a mikrofluidických systémů, což současně představuje perspektivní oblasti budoucího vývoje.

Abstract:

The analytical usability and applicability of various electrochemical detection (ECD) systems combined with high-performance liquid chromatography (HPLC) is discussed in the present doctoral thesis. The investigation of specific electrochemical characteristic (broad potential window, inertness) of boron doped diamond (BDD) and its analytical utilization, as a non-traditional electrode material in HPLC, is covered in the first section of the thesis. A HPLC-ECD method for the determination of PDE5 inhibitors (Viagra, Levitra) and their main N-dealkylated metabolites, based on BDD as a working electrode, is described. A working potential of +1520 mV (vs. Pd/H2) was used for a sensitive one-run detection of the baseline separated drugs including internal standard in the human plasma. The method developed is fast (12 minutes), isocratic, highly sensitive (LODs in the ng ml-1 range), and only minute plasma volume (150 ul) is required. The used thin-layer BDD electrode proved to be of great significance for sensitive amperometric detection of not easily oxidizable analytes, such as the aforementioned piperazine derivatives. Carbon fiber microelectrodes (CFME) exhibit some unique analytical properties, compared to their conventional sized counterparts. The excellent sensing characteristics of cylindrical microelectrodes and resolving power of HPLC are the key features for the promising HPLC-ECD hyphenation, as demonstrated by four different application examples in the second section. A model mixture of common phenolic acids (gallic, protocatechuic, gentisic, 4 hydroxybenzoic and caffeic acid) was separated to test the sensing capabilities of the CFME as an amperometric detector in HPLC. Even for trace concentrations of phenolic acids, excellent signal stability and signal-to-noise ratio was observed. Brominated phenols (BP), extensively used as flame retardants - e.g. 3,3,5,5-tetrabromobisphenol A (TBBA) are considered to be neurotoxic, persistent and bioaccumulative. Amperometric CFME-based detector in a liquid-chromatographic arrangement was used for the determination of 4-bromophenol, 2,4-dibromophenol, 2,6-dibromophenol, 2,4,6-tribromophenol and TBBA. For the simultaneous detection of BP, working potential of +1450 mV (vs. Ag/AgCl) was chosen. The calculated limits of detection (LOD) for the studied analytes were within the range of 1,8-56,6 ng ml-1. The method was applied to determination of BP in spiked water, and of TBBA in a CRT monitor plastic casing. The presence of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-oxodG) in blood plasma is considered an important marker of oxidative stress and DNA damage. Elevated levels of 8-oxodGuo were found in the urine and lung tissues of smokers as well as in body fluids and DNA of patients with serious disorders. Unfortunately, plasma concentrations of 8-oxodG cannot often be reliably distinguished as they lie below quantification limits of many analytical methods. ECD belongs to the most sensitive assays of 8-oxodG currently available. The electrochemical detector based on CFME was successfully tested on the standard solution of 8-oxodG at physiological concentration as well as on a plasma sample of a cancer patient. The achieved results indicate that the technique is capable of routine monitoring of 8-oxodG in blood plasma. Surface CFME modifications (resulting in altered analytical selectivity) represent certainly a very promising research area. Some analytical aspects regarding copper-coated CFME (Cu-CFME) are briefly discussed. Cu-CFME, prepared and processed adequately, was successfully applied to direct-current amperometric determination of selected disaccharides, prior their liquid-chromatographic separation.

Keywords

HPLC, elektrochemická detekce, borem dopované diamantové elektrody, uhlíkové mikroelektrody

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 7. 2015

Accessible from:: 24. 7. 2015

Thesis defence

• Supervisor: doc. RNDr. Petr Bednář, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry