Funkční analýza mutantních typů měď transportující ATPasy (ATP7B) identifikovaných u pacientů s Wilsonovou chorobou

Bc. Lenka Grohmannová

Master's thesis

Functional analysis of the mutant types of transporting copper-ATPase (ATP7B) identifed in Wilson disease patients

Abstract:

Wilsonova nemoc je závažné onemocnění s autosomálně recesivní dědičností charakteristické akumulací mědi v organismu. Molekulární podstatou onemocnění jsou mutace v genu pro měď transportující ATPasu (ATP7B). Hlavním cílem diplomové práce byla funkční analýza genu ATP7B. Metodou místně cílené mutageneze byly připraveny čtyři mutované varianty genu ATP7B s mutacemi H1069Q, 3402delC, W779X a R778G. Translací in vitro byly připraveny fragmenty mutantního proteinu a byl sledován vliv jednotlivých mutací na degradaci proteinu v čase ve srovnání s nemutovaným proteinem. Analýza potvrdila teorii, že bodové mutace mají negativní vliv na produkt genu ATP7B, měď transportující ATPasu. Ovlivňují zejména stabilitu proteinu vlivem konformačních změn v terciální struktuře proteinu. U mutace H1069Q bylo potvrzeno, že záměnou vysoce konzervované aminokyseliny v oblasti SEHPL motivu dochází k těžkému poškození funkce ATPasy a nedochází k fosforylaci proteinu. Mutace 3402delC způsobuje změnu čtecího rámce a tím předčasné vytvoření stop kodonu. Dochází k předčasné terminaci translace a vzniká zkrácený (nefunkční) protein. Předčasnou terminaci translace způsobuje i mutace W779X. V důsledku této mutace dochází ke zkrácení proteinu až o 47% a ke ztrátě jedinečných motivů nutných pro správnou funkci proteinu. U mutace R778G dochází k poškození čtvrtého transmembránového motivu. Toto poškození má za následek poškození funkce proteinu

Abstract:

Wilson disease is an autosomal recessive inherited disorder of copper metabolism, characterized by abnormal accumulation of copper in several tissues. The disease is caused by mutations in the ATP7B gene. The principal aim of my diploma thesis was functional analysis of the ATP7B gene. The four mutant variants of ATP7B gene were prepared using the site direct mutagenesis. This variants contained mutations H1069Q, 3402delC, W779X and R778G. Degradation of mutant and wild type proteins was observed after in vitro translation Functional analysis of the gene confirms the theory that the mutations have negative effect on the copper transporting ATPase. The mutations especially affect the stability of protein by confirming changes in tercial structure. It has been confirmed that the mutation H1069Q, damages the highly conserved amino-acid SEHPL motive and is essential for folding and intracellular trafficking of the protein. For mutation 3402delC the premature creation of stop kondon is characteristic that makes the previous termination of translation. It results in a smaller protein, which is involved in highly conserved parts of the protein. For the mutation W779X is characteristic reduction of protein about 47 %. The loss of unique motives that are necessary for the correct function of the protein occurs. Mutation R778G as well as near previous mutation, happens to damage fourth transmembrane motive.

Keywords

ATPasa, ceruloplasmin, E. coli, mutace, transkripčně/translační reakce, transformace, Wilsonova nemoc, ATPase, copper, transcription, translation, Wilson disease

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 5. 2007

Thesis defence

• Date of defence: 8. 6. 2007
• Supervisor: RNDr. Libor Kozák, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry