Studium molekulární patofyziologie Diamondovy-Blackfanovy anémie

Mgr. Ondřej JAHODA

Doctoral thesis

Study of the Molecular Pathophysiology of Diamond-Blackfan Anemia

Abstract:

Diamondova-Blackfanova anémie (DBA) je vzácná vrozená aplázie erytropoézy obvykle charakterizována závažnou makrocytární anémií. Onemocnění mohou doprovázet různé vrozené vývojové vady a predispozice k nádorovým onemocněním. Hlavní genetickou příčinou DBA jsou mutace v genech kódujících ribozomální proteiny (RP), které vedou k narušení ribozomální biogeneze. Cílem této disertační práce bylo studovat molekulárně patofyziologický mechanismus DBA s využitím a) DBA buněčného modelu s haploinsuficiencí Rp (Rpl5 a Rps19) a b) vzorků vybraných pacientů z Českého a Slovenského registru DBA. V Rp haploinsuficientních buňkách jsme zjistili zvýšené hladiny reaktivních forem kyslíku (ROS) a zvýšené oxidační poškození DNA, které vedlo k aktivaci signální dráhy odpovídající na poškozenou DNA. Zvýšený oxidační stres v Rp haploinsuficientních buňkách potvrdily také výsledky metabolomické analýzy, které ukázaly změny metabolomu charakteristické pro odpověď na tento stres. Oxidační stres byl v Rp haploinsuficientních buňkách současně doprovázen zvýšenou produkcí prozánětlivých cytokinů a byl prokázán příspěvek secernovaných faktorů/cytokinů do indukce patologických charakteristik pozorovaných v buňkách, včetně rozvoje oxidačního poškození DNA. Patologický fenotyp buněčného modelu byl rovněž asociován s aktivací p53 a indukcí apoptózy i senescence. Výše popsané patologické změny byly pozorovány i v primárních vzorcích pacientů s DBA, konkrétně v in vitro kultivovaných erytroblastech a v trepanobioptických vzorcích kostní dřeně, resp. v séru. Antioxidační nebo protizánětlivá léčba Rp haploinsuficientních buněk pak vedla k normalizaci hladiny ROS, snížení oxidačního poškození DNA i aktivace p53. Významně zvýšenou hladinu ROS jsme pozorovali také v erytrocytech pacientů, a to i navzdory aktivovanému systému jejich antioxidační ochrany. Dále jsme zjistili zvýšenou expozici fosfatidylserinů na vnější membráně u erytrocytů DBA pacientů, značící jejich zvýšenou tendenci k programované smrti - eryptóze. Analýza krevních vzorků DBA pacientů zahrnovala i tři členy rodiny s první popsanou substituční mutací v genu RPS7 asociovanou s DBA s velmi heterogenním fenotypem. V této případové studii jsme ukázali, že závažnost fenotypu anémie byla asociována se zvýšenou hladinou erytrocytárních ROS, s membránovými změnami typickými pro eryptózou a deregulovaným erytrocytárním metabolismem. Naše zjištění tak naznačují, že tíže anemie u DBA, může být ovlivňována i změněnými charakteristikami erytrocytů zahrnujícími nadměrný oxidační stres, změněný metabolismus a tendencí erytrocytů podléhat eryptóze. Závěrem lze shrnout, že naše výsledky ukázaly na komplexnost patofyziologie DBA s důležitým příspěvkem prozánětlivých cytokinů a nadměrného oxidačního stresu spojeného s oxidačním poškozením buněk. Domníváme se, že léčba zaměřená na snížení oxidačního stresu a/nebo potlačení prozánětlivých cytokinů by mohla zmírnit závažnost onemocnění. V tomto ohledu jsou nicméně zapotřebí další studie. Další výzkum si zaslouží také potenciální souvislost mezi oxidačním poškozením, zánětlivými cytokiny a rizikem vzniku rakoviny u DBA.

Abstract:

Diamond-Blackfan anemia (DBA) is a rare congenital erythropoiesis aplasia usually characterized by severe macrocytic anemia. The disease phenotype includes various congenital developmental defects in a subset of patients and a predisposition to cancer. The main genetic cause of DBA is mutations in genes encoding ribosomal proteins (RP), which lead to disruption of ribosomal biogenesis. This dissertation thesis aimed to study the molecular pathophysiological mechanism of DBA using a) DBA cell model with Rp haploinsufficiency (Rpl5 and Rps19) and b) samples of selected patients from the Czech and Slovak DBA registry. In Rp haploinsufficient cells, we found increased levels of reactive oxygen species (ROS) and increased oxidative DNA damage, which led to the activation of the DNA-damaged response signaling pathway. The increased oxidative stress in Rp haploinsufficient cells was also confirmed by metabolomic analyses, which showed metabolome changes characteristic of the response to this stress. Oxidative stress in Rp haploinsufficient cells was concomitantly accompanied by increased production of pro-inflammatory cytokines. In addition, the contribution of secreted factors/cytokines to the induction of pathological characteristics observed in the cells, including oxidative DNA damage, was demonstrated. The pathological phenotype of the cell model was also associated with p53 activation and induction of apoptosis and senescence. The pathological changes described above were also observed in primary samples from DBA patients, specifically in in vitro cultured erythroblasts and in bone marrow trepanobiopsy samples or serum. Antioxidant or anti-inflammatory treatment of Rp haploinsufficient cells resulted in the normalization of ROS levels and reduction of oxidative DNA damage and p53 activation. Significantly elevated ROS levels were also observed in erythrocytes of DBA patients, despite the activation of their antioxidant protection system. Furthermore, we found increased exposure of phosphatidylserines on the outer membrane of DBA erythrocytes, leading to their increased tendency to programmed death - eryptosis. Analysis of blood samples of DBA patients included three family members with the first described DBA-associated RPS7 substitution mutation and a highly heterogeneous phenotype. In this case report, we showed that the severity of the anemia phenotype was associated with elevated erythrocyte ROS levels, membrane changes typical for eryptosis, and deregulated erythrocyte metabolism. Thus, our findings suggest that anemia in DBA, may also be influenced by altered erythrocyte characteristics involving excessive oxidative stress, altered metabolism, and the tendency of erythrocytes to undergo eryptosis. In conclusion, our results demonstrated the complexity of DBA pathophysiology with an important contribution of pro-inflammatory cytokines and excessive oxidative stress associated with oxidative cell damage. We suggest that treatments aimed at reducing oxidative stress and/or suppressing pro-inflammatory cytokines could alleviate the severity of the disease. However, further studies are needed in this regard. The potential association between oxidative damage, pro-inflammatory cytokines, and cancer risk in DBA also deserves further investigation.

Keywords

Diamond-Blackfanova anémie, ribozomopatie, reaktivní formy kyslíku, oxidační poškození DNA, zánětlivé cytokiny, životnost erytrocytů

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 7. 2024

Thesis defence

• Supervisor: doc. Mgr. Monika Horváthová, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Biology / Medical Biology