Proteiny asociované s rostlinnými telomerami

Mgr. Kateřina Adamusová, Ph.D.

Doctoral thesis

Proteins associated with plant telomeres

Anotácia:

Rostliny jsou nepohyblivé eukaryotické organismy, které si vyvinuly sofistikovaný systém určený k přizpůsobení se změnám prostředí. V tomto systému hraje významnou úlohu epigenetická regulace chromatinu, díky které se staly důležitými modelovými organismy pro studium epigenetiky, včetně biologie telomer. Telomery jsou nukleoproteinové struktury na koncích eukaryotických chromozomů, jenž jsou zásadní pro udržování integrity genomu, protože chrání chromozomy před ztrátou genetické informace v důsledku neúplné replikace DNA. Rovněž slouží k odlišení přirozených konců chromozomů od dvojvláknových zlomů DNA. Telomery se skládají z krátkých, opakujících se sekvencí nukleotidů: například TTAGGG u savců nebo TTTAGGG u většiny rostlin. S výrazným přispěním naší laboratoře byly charakterizovány rostlinné druhy s nekanonickou telomerovou sekvencí. Hlavní část této práce se zabývá optimalizací protokolů vedoucí k charakterizaci rostlinného telomerového proteomu. Jedná se o poměrně náročný metodologický problém, protože neexistuje metoda, která by umožnila jednoznačnou identifikaci neznámých proteinů asociovaných s určitou oblastí genomu. V této práci byla optimalizována metoda PICh (Proteomics of Isolated Chromatin), pomocí které byly identifikovány lidské telomerové proteiny. Dále byly pro analýzu rostlinných telomerových proteinů optimalizovány přístupy založené na využití konstruktů TALE (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) a CRISPR/dCas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) specificky se vázajících na telomery. Přes veškerou snahu a optimalizace protokolů nebyl tento cíl splněn. Navzdory tomu byl modifikovaný protokol pro izolaci rostlinného chromatinu využit v následných analýzách. Rostlinný telomerový chromatin se svými vlastnostmi pohybuje na rozhraní mezi heterochromatinem a euchromatinem, přičemž jsou více zastoupené heterochromatinové histonové modifikace. V této práci jsme se zaměřili na stav telomerového chromatinu v rostlinách Arabidopsis thaliana, které mají nefunkční enzymy odpovědné za modifikaci histonů. Narozdíl od savčích buněk epigenetický stav rostlinných telomer nekoreluje s jejich strukturou, ani délkou. Dále jsme porovnávali telomerový chromatin v rostlinách s kanonickou a nekanonickou telomerovou sekvencí. U těchto rostlin jsme pozorovali dva typy epigenetických telomerových modifikací, které však nekorelovaly se sekvencí ani délkou telomer, velikostí genomu či fylogenetickou příbuzností rostlin. Správné funkci rostlinných telomer tedy neodpovídá jeden unikátní vzor modifikací telomerových histonů, ale důležitější roli pravděpodobně hraje jejich celkové strukturní uspořádání.

Abstract:

Plants are important model organisms in epigenetic studies and telomere biology research. Plants as sessile organisms developed a sophisticated system – including epigenetic regulation – for adaptation on environmental changes. Telomeres, nucleoprotein structures at the ends of eukaryotic chromosomes, represent functionally important regions. Telomeres are crucial for a maintenance of genome integrity protecting chromosomes from a loss of a genetic information due to the incomplete DNA replication and help distinguishing the natural chromosome ends from double-strand DNA breaks. Telomeres consist of short DNA repeats, sequence of which is relatively conservative across kingdoms, e.g., TTAGGG in mammals and TTTAGGG in most of plants. Interestingly, numerous plant representatives with non-canonical telomeric repeat unit were characterized as well. Crucial part of my study was an optimization of protocols for characterization of plant telomere proteome. This task represented a non-trivial methodological problem due to the absence of a straightforward method enabling identification of proteins associated with a specific genomic region. In this thesis, a protocol used for an identification of human telomeric proteins, PICh (Proteomics of Isolated Chromatin), and approaches based on telomere-specific TALE and CRISPR/dCas systems were optimized and utilized. Despite using several protocols and performing numerous optimizations, this goal was not achieved. Nevertheless, a new protocol for a purification of plant telomeric chromatin, which was used in subsequent studies, was developed. Plant telomeric chromatin displays dual character with both heterochromatin- and euchromatin-specific epigenetic modifications. Our aim was to analyze stability of telomeres and structure of telomeric chromatin in Arabidopsis thaliana plants with dysfunction of histone modifying enzymes. Based on our analyses and in contrast to findings in mammalian cells, the epigenetic structure of the telomeric chromatin does not correlate with changes in telomere lengths and/or a general modulation of the epigenome. Next, we identified two patterns of telomeric histone modifications in plants with canonical and non-canonical telomeres, which were related neither to the respective telomere sequences or lengths, genome size nor to the phylogenetic relationship of plants. Thus, the proper function of plant telomeres does not correlate with the exclusive pattern of histone epigenetic marks.

Keywords

Telomery, telomerové proteiny, struktura telomer, chromatin, epigenetika

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 12. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 31. 1. 2020
• Vedúci: doc. Mgr. Miloslava Fojtová, CSc.
• Oponent: doc. Mgr. Jan Havliš, Dr., doc. RNDr. David Honys, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics