Tolerance poškození DNA genotoxickými komplexy platiny

Bc. Simona Zahrádková

Master's thesis

Tolerance and bypass of DNA damage by genotoxic platinum complexes

Abstract:

Jedním z mechanismů vedoucích k rezistenci nádorových buněk při léčbě cisplatinou je translézová syntéza (TLS). Tato práce je zaměřena na studium tolerance specifických polymeráz k poškozením DNA, která jsou způsobena analogy cisplatiny obsahujícími enantiomerní diaminové ligandy, cis-[PtCl2(R,R-DAB)] a cis-[PtCl2(S,S-DAB)] (DAB=2,3-diaminobutan). Pozornost je věnována také studiu inkorporací chybného nukleotidu během syntézy přes adukt. Teoretická část je zaměřena na mechanismus působení cisplatiny a vývoj nových potenciálních léčiv na bázi komplexů platiny. Průběh a výsledky práce jsou uvedeny v její praktické části. Připravené adukty, tvořené 1,2-d(GpG) můstky na templátovém oligonukleotidu, byly charakterizovány pomocí DMS. Následně byla provedena řada polymeračních experimentů popisujících schopnost polymerázy éta a Klenowova fragmentu (exo-, KF-), katalyzovat inkorporaci nukleotidů v templátové sekvenci 3‘-GGT-5‘ nesoucí adukt, případně pokračovat v syntéze i dále za adukt. V další sérii experimentů byla pozorována schopnost polymeráz inkorporovat nekomplementární nukleotidy v této 3‘-GGT-5‘ sekvenci templátu. Byla pozorována větší inhibice syntézy přes adukty s objemným DAB ligandem ve srovnání s aduktem cisplatiny. Pro všechny studované komplexy bylo pozorováno, že velká část produktů syntézy nedosáhla délky překonávající místo aduktu. Z výsledků experimentů zaměřených na schopnost polymeráz inkorporovat nekomplementární nukleotid v místě aduktu je patrné, že mutagenita v reakcích s polymerázou éta byla závislá na modifikaci templátu, naopak v reakcích s KF- docházelo u všech vzorků nejčastěji k mutacím při inkorporaci proti 5’-G aduktu. Obecně ze získaných výsledků vyplývá, že nejvíce mutagenní je adukt cis-[PtCl2(S,S-DAB)] a nejméně adukt cisplatiny. Adukt cisplatiny ovšem inhibuje syntézu méně než adukty s DAB ligandem, čímž se pravděpodobnost mutace zvyšuje. Syntéza delších produktů po překonání aduktu se ve všech porovnávaných vzorcích příliš nelišila.

Abstract:

One of the mechanisms leading to the resistance of tumor cells to cisplatin is translesion synthesis (TLS). This thesis is focused on the study of specialised TLS polymerases tolerance to DNA damage, caused by cisplatin analogs containing enantiomeric diammine ligands cis-[PtCl2(R,R-DAB)] and cis-[PtCl2(S,S-DAB)] (DAB = 2,3-diamminobutane). Attention is also paid to the study of misincorporations during synthesis over the adduct. The theoretical part concentrates on the mechanism of cisplatin activity and development of new potential drugs based on platinum complexes. Progress and results of this work are presented in its practical part. 1,2-d(GpG) adducts prepared on the template olionucleotide were characterized by DMS. Subsequently, a number of polymerization experiments were performed to describe the ability of the polymerase éta and Klenow fragment (exo-, KF-), to catalyze the incorporation of nucleotides opposite the teplate sequence 3‘-GGT-5‘ with the adduct, and their ability to continue in the synthesis behind the adduct. An ability of polymerases to incorporate non-complementary nucleotides in the 3‘-GGT-5‘ template sequence was observed in another series of experiments. The inhibition of the synthesis through adducts with the bulky DAB ligand was higher compared to the cisplatin adduct. From the results of experiments based on an ability to incorporate a non-complementary nucleotide opposite adducts it can be found, that the mutations in reactions with polymerase éta depended on the modification of the template, while in reactions with KF- were mutations more frequent during incorporation against 5'-G of adduct. In general, the results show that the most mutagenic adduct is cis-[PtCl2(S,S-DAB)] and the least cisplatin adduct. However, cisplatin adduct blocks synthesis less than adducts with bulky DAB ligand, thereby increasing the likelihood of mutation. Synthesis behind the adduct was similar for all the samples compared.

Keywords

cytostatika, DNA, cisplatina, translézová syntéza, polymeráza éta, [PtCl2(DAB)], cytostatics, cisplatin, translesion synthesis, polymerase éta

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 11. 6. 2019
• Supervisor: doc. Mgr. Olga Nováková, Dr.
• Reader: Hana Kostrhunová

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Physics / Biophysics