Použití metody MLPA k detekci chromozomálních aberací v klinické genetice

Mira MAZÁČOVÁ

Bachelor's thesis

Detection of chromosomal imbalancies by multiple ligation-dependent probe amplification (MLPA) in routine diagnostic

Abstract:

Chromozomální aberace jsou jednou z příčin vrozených vývojových vad a vývojového opoždění u člověka. Jejich studiem se zabývá klinická cytogenetika. Základní cytogenetickou metodou je kultivace buněk, zisk metafázních chromozomů a jejich hodnocení. Rozlišovací úroveň této metody je však nízká a subtilnější změny mohou tedy při tomto hodnocení uniknout. K vyřešení tohoto problému byly vyvinuty sofistikovanější metody. Jednou z těchto metod je i metoda MLPA (Multiple Ligation- dependent Probe Aplification), jejíž zavedení a optimalizace pro použití jak v postnatální, tak prenatální cytogenetice bylo cílem této práce. V bakalářské práci je popisováno provedení a analýza výstupních dat metody MLPA. Diskutovány jsou vlivy hlavních negativních fenoménů metody, jakými jsou nízká koncentrace DNA ve vyšetřovaném vzorku, nekompletní denaturace dvoušroubovice vyšetřované DNA či přítomností ´slopingu´ píků u výstupních elektroforetogramů. Metodou MLPA bylo vyšetřeno celkem 8 vzorků DNA: 3 vzorky DNA izolované z periferní krve pacientů s idiopatickou mentální retardací, 4 vzorky DNA izolované z tkáně choria a 1 vzorek izolovaný z amniocytů plodové vody. Vzorky byly testovány prostřednictvím komerčně vyráběných a distribuovaných SALSA MLPA kitů P036 a P070, které se specificky vážou na subtelomerické oblasti chromozomu a mohou tak detekovat změny v těchto oblastech. U 6 vyšetřovaných vzorků byla potvrzena očekáváná chromozomální aberace. V 1 případě byla nalezena aberace nová. Výsledky metody MLPA byly následně ověřeny dalšími metodami.

Abstract:

Chromosomal aberrations play a role in the pathogenesis of congenital malformations or developemental delay. Clinical cytogenetics focuses on these chromosomal aberrations. One of the basic cytogenetic method is cell cultivation, obtaining metaphases chromosomes and their analysis. Differential level of this method is not so sensitive, and cryptic aberrations can evade from detection. Due to this fact new high sensitive methods revealing gains and losses of the genetic material were developed. One of these methods is MLPA (Multiple Ligation- dependent Probe amplification). Introduction and application of this method in prenatal and postnatal cytogenetic is main goal of this thesis. This bachelor thesis describes and analyses output data of the MLPA method. Main negative effects of this method are discussed, such as low concentration of DNA in the examined sample, incomplete denaturation of double-stranded DNA or the presence of 'sloping' peaks in the output electrophoretograms. There were tested 8 DNA samples by MLPA method: 3 DNA samples isolated from peripheral blood of patients with idiopathic mental retardation, 4 DNA samples isolated from chorionic tissue and 1 DNA sample isolated from amniocytes in amniotic fluid. Samples were tested by commercially produced and distributed SALSA MLPA kits P036 a P070 that can specifically bind to the subtelomeric region of the chromosome and detect changes in these areas There were confirmed expected chromosomal aberrations in 6 of the investigated samples. In one case new aberration was found.

Keywords

MLPA, cytogenetika, chromozomální aberace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2013

Accessible from:: 26. 4. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 27. 5. 2013
• Supervisor: RNDr. Pavlína Čapková, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology