The role of hyaluronic acid in the development of peritoneal fibrosis and adhesions

Mgr. Anna Kocurková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Peritoneální adheze představují závažnou a velmi častou pooperační komplikací, která se může projevit chronickou bolestí, neprůchodností střev, neplodností a v nejvážnějších případech může vést i k úmrtí. Skládají se především z makromolekul extracelulární matrix (ECM) a vznikají nejčastěji v důsledku poranění tkáně a následné deregulace procesů nezbytných ke správnému zhojení. Pro odstranění adhezí je nutné podstoupit opětovný chirurgický zákrok, jež často vede ke vzniku sekundárních adhezí, a je tedy důležitá zejména jejich prevence, která zahrnuje správnou chirurgickou praxi, aplikaci anti-adhezivních bariér a případnou aplikaci léčiv účinkujících v regulaci procesů hojení. Kyselina hyaluronová (HA) je silně hydrofilní glykosaminoglykan a je produkována jako jedna ze složek ECM. Biotechnologicky produkovaná HA je díky hydrofilitě a obecně biokompatibilním vlastnostem hojně používána v kosmetice a biomedicínských aplikacích. Tato práce vznikla v blízké spolupráci s firmou Contipro a.s. a zabývá se výzkumem role endogenní HA a exogenní HA chemicky modifikované lauroylovými řetězci (lau-HA), vyvinuté jako potenciální anti-adhezivní materiál, v rozvoji peritoneální fibrózy a peritoneálních srůstů. I když je exogenní HA hojně používána jako složka anti-adhezivních bariér, málo se toho ví o roli endogenní HA produkované při vzniku srůstů. V souvislosti s peritoneální fibrózou byla role endogenní HA částečně popsána při peritoneální dialýze a endometrióze, které mohou vést rovněž ke vzniku adhezí, proto předpokládám, že endogenní HA by mohla regulovat i rozvoj pooperačního vzniku adhezí. Změna metabolismu endogenní HA byla pozorována in vivo na myším modelu peritoneálních adhezí indukovaných podrážděním, osychem a ligací peritoneální membrány. Indukce adhezí vedla ke zvýšené produkci HA a vyšší proteinové expresi hyaluronan syntáz (HAS1-3), hyaluronidáz (HYAL1-2) a receptoru CD44. Mechanismy jejího působení byly studovány in vitro na mezoteliální linii MeT-5A a myších primárních mezoteliálních buňkách po stimulaci transformujícím růstovým faktorem β (TGFβ) a po inhibici produkce HA použitím 4-methylumbelliferonu (4-MU) a 2-deoxyglukózy (2-DG). Po inhibici HA byla sledována změna v genové expresi zejména HAS2 a HYAL2, byla snížená přítomnost pro-fibrotických markerů (fibronektin, αSMA (z anglického α smooth muscle actin), SNAIL1) a snížená adherence buněk pravděpodobně skrze ovlivnění AKT signalizace. V další části projektu jsem se podílela na testování anti-adhezivních filmů z lau-HA, u kterých jsem sledovala jejich biologické vlastnosti. Nejdříve byla ověřena jejich bezpečnost in vitro na modelu 3T3 fibroblastů a in vivo v břišní dutině zdravých myší. Po zjištění, že lau-HA filmy s vybraným stupněm substituce nejsou toxické a nezpůsobují chronický zánět, byla provedena jejich hlubší analýza. Byl zkoumán jejich osud v organismu po intraperitoneální aplikaci. Prokázali jsme, že lau-HA není depolymerizován v peritoneální dutině, ale je dopraven lymfatickým systémem zejména do jater, kde je metabolizován na produkty tělu vlastní. Kromě farmakokinetiky byla blíže zkoumána adsorpce proteinů a následná adherence buněk, což je důležité z hlediska možného selhání a zapouzdření materiálu kvůli jeho nízké biokompatibilitě. V porovnání s jinými vybranými filmy, hydrofobní lau-HA adsorbovaly větší množství proteinů, nicméně buňky adherovaly porovnatelně. Nakonec byl proveden test účinnosti lau-HA a dalších vybraných filmových a gelových materiálů v in vivo myším modelu adhezí ukazující slibné výsledky vyvíjených materiálů. Tato práce ukazuje, že endogenní HA pravděpodobně podporuje rozvoj pe

Abstract:

ritoneální fibrózy a adhezí, i když aplikace anti-adhezivních bariér založených na biotechnologicky produkované HA vede k redukci vzniku adhezí. Tento paradox může být způsoben řadou faktorů zahrnujících například rozdílnou koncentraci exogenní a endogenní HA, teoreticky by mohlo přispět i ovlivnění signalizace molekulovou hmotností a případnými chemickými modifikacemi HA v bariérách. Podrobné mechanismy působení endogenní i exogenní HA ve vzniku pooperačních peritoneálních adhezí je nicméně nutné dále studovat.

Abstract:

Peritoneal adhesions are a serious and very common post-operative complication that can result in chronic pain, intestinal obstruction, and infertility and in the most severe cases can lead to death. They are composed primarily of extracellular matrix (ECM) macromolecules and are most often formed as a result of tissue injury and subsequent deregulation of processes necessary for proper healing. The removal of adhesions requires re-operation, which often leads to the formation of secondary adhesions, and therefore their prevention, which includes proper surgical practice, the application of anti-adhesive barriers and the possible application of drugs acting in the regulation of the above-mentioned mechanisms, is particularly important. Hyaluronic acid (HA) is a highly hydrophilic glycosaminoglycan and is produced as one of the components of the ECM. Due to its hydrophilicity and generally biocompatible properties, biotechnologically-produced HA is widely used in cosmetics and biomedical applications. This work was carried out in close collaboration with Contipro a.s. and deals with the investigation of the role of endogenous HA and exogenous HA chemically modified with lauroyl chains (lau-HA) developed as a potential anti-adhesive material in the development of peritoneal fibrosis and peritoneal adhesions. Although exogenous HA is widely used as a component of anti-adhesive barriers, little is known about the role of endogenous HA produced in adhesion formation. In the context of peritoneal fibrosis, its role has been partially described in peritoneal dialysis and endometriosis, which can also lead to adhesion formation, so I hypothesise that endogenous HA may also regulate the development of post-operative adhesion formation. Alteration of endogenous HA metabolism was observed in vivo in a mouse model of peritoneal adhesions induced by irritation, desiccation and ligation of the peritoneal membrane. Induction of adhesions led to increased HA production and higher protein expression of HA synthases (HAS1-3), hyaluronidases (HYAL1-2) and cluster of differentiation 44 (CD44). Its mechanisms of action were studied in vitro in the mesothelial cell (MC) line MeT-5A and in mouse primary MCs after stimulation with the transforming growth factor β (TGFβ) and after inhibition of HA production using 4-methylumbelliferone (4-MU) and 2-deoxyglucose (2-DG). After HA inhibition, we observed a change in gene expression, particularly of HAS2 and HYAL2, decreased presence of pro-fibrotic markers (fibronectin, α smooth muscle actin (αSMA) and SNAIL1) and decreased cell adherence, probably through affecting AKT signalling. In the next part of the project, I was involved in the testing of lau-HA anti-adhesive films and monitored their biological properties. First, their safety was verified in vitro in a 3T3 fibroblast model and in vivo in the abdominopelvic cavity of healthy mice. Further, the fate of lau-HA films in the body after intraperitoneal application was investigated and we found that lau-HA is not depolymerized in the abdominopelvic cavity but is transported through the lymphatic system, mainly to the liver, where it is metabolized to products intrinsic to the body. In addition to pharmacokinetics, protein adsorption and subsequent cell adherence were examined in more detail, which is important in terms of possible failure and encapsulation of the material due to its low biocompatibility. Compared to other selected films, the hydrophobic lau-HA adsorbed a greater number of proteins, however, cells adhered comparably. Finally, the efficacy of lau-HA and other selected film and gel materials was tested in an in vivo mouse model of adhesions showing promising results for the developed materials. This work shows that endogenous HA is likely to promote the development of peritoneal fibrosis and adhesions, although the application of anti-adhesive barriers based on biotechnologically produced HA leads to a reduction in adhesion formation.

Abstract:

This paradox could be due to a number of factors including, for example, different concentrations of exogenous and endogenous HA, and theoretically, molecular weight and possible chemical modifications of HA in the barriers could also contribute to the distinct signalling. However, the detailed mechanisms of action of endogenous and exogenous HA in the development of post-operative peritoneal adhesions require further investigation.

Keywords

fibróza, peritoneální srůsty, kyselina hyaluronová, anti-adhezivní bariéry, fibrosis, peritoneal adhesions, hyaluronic acid, anti-adhesive barriers

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 7. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 29. 8. 2023
• Supervisor: Mgr. Gabriela Ambrožová, Ph.D.
• Reader: Martin Mollenhauer, PhD, Gloria Huerta Angeles, PhD

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Animal physiology, immunology and developmental biology / Animal physiology, immunology and developmental biology