Detekce Borrelia burgdorferi s.l. v klíšťěti obecném na jižní Moravě

Mgr. Václav Hönig

Master's thesis

Genomospecies of Borrelia burgdorferi s.l. in the common tick in southern Moravia

Abstract:

Anotace: Lymská borrelióza (LB) je jedním z nejrozšířenějších klíšťaty přenosných onemocnění na severní polokouli. V České republice byla v letech 1990-2006 průměrná roční nemocnost 32 případů na 100 000 obyv. (s rozsahem 14 až 61). Původce LB, spirochéta Borrelia burgdorferi, byla izolována teprve v roce 1982 v USA, potom rychle následovaly další izoláty z různých zdrojů a zemí. Podrobnější analýzy prokázaly jejich značnou biologickou heterogenitu. Dnes je popsáno již 12 genomických skupin (označovaných také jako genospecies, genomospecies apod.), které se navzájem liší ekologicky, epidemiologicky i schopností vyvolávat různé klinické formy onemocnění. Za prokazatelně patogenní pro člověka jsou dnes považovány tři genomické druhy: B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii a B. garinii. Jedním z ukazatelů umožňujících odhad rizika LB pro člověka v přírodních ohniscích je sledování prevalence jejího původce ve vektorech – klíšťatech. Pro takové sledování je ovšem potřebné zvolit vhodnou metodu detekce patogena v klíštěti, a její ověření bylo cílem naší práce. Klíšťata Ixodes ricinus byla sbírána vlajkováním v měsíčních intervalech od května do listopadu 2006 a v březnu 2007 na 3 lokalitách jižní Moravy (Brněnská přehrada, Vranovská přehrada, Valtice). Všechny lokality jsou vyhledávanými rekreačními oblastmi. Klíšťata byla vyšetřována mikroskopií v zástinu (ZM) a pomocí PCR s primery specifickými pro komplex Borrelia burgdorferi s.l. PCR pozitivní vzorky byly podrobeny druhově specifické PCR pro detekci 3 patogenních genomospecies. Hodnota populační hustoty klíšťat kolísala mezi lokalitami i mezi ročními obdobími. Na všech lokalitách průkazně převyšovala denzita nymf denzitu dospělců. Nymfy (285) byly vyšetřeny mikroskopií v zástinu a druhá část (240) byla vyšetřena pomocí PCR. Dospělci (100) byli longitudinálně rozpůleni sterilním skalpelem: jedna polovina každého jedince byla vyšetřena mikroskopicky a druhá PCR. Prevalence borrelií u nymf podle ZM (9,8 %) se prokazatelně lišila od prevalence stanovené pomocí PCR (3,3 %). U dospělců dosáhla prevalence v ZM 18 %, a v PCR u těchže jedinců 23 %. Vzorky pozitivní oběma metodami tvořily 12 %, ZM pozitivní a PCR negativní 6 %, ZM negativní a PCR pozitivní 11 % a 71 % vzorků bylo negativních v obou metodách. Rozdíl v citlivosti PCR mezi vyšetřením dospělců a nymf byl zřejmě způsoben inhibicí PCR necílovou DNA, které obsahovaly více směsi nymf, tvořené více jedinci, než směsi dospělců. Pomocí druhově specifické PCR byla u 25 z 31 PCR pozitivních vzorků identifikována jedna ze tří genomických skupin. Nejvíce zastoupeny byly genomické skupiny B. garinii (33,3 %) a B. afzelii (35,9 %) méně pak B. burgdorferi s.s. (12,8 %). V jednom případě (2,6 %) byla prokázána koinfekce jednoho klíštěte B. afzelii a B. garinii současně.

Abstract:

Abstract: Lyme disease (LD) is one of the most widespread tick-borne infections in the northern hemisphere. In the Czech Republic, the mean annual incidence of LD was 32 cases per 100,000 inhabitants during the years 1990-2006 (the range, 14-61). The causative agent of LD, Borrelia burgdorferi, was isolated in the U.S.A as late as 1982. Subsequently many other isolates were reported from various sources and countries. Analyses have demonstrated a high degree of their biological heterogeneity. There are 12 genomic groups (also called genomospecies, genospecies etc.) of B. burgdorferi s.l. at present:they differ ecologically, epidemiologically, and in their potential to cause various clinical forms of LD. Three genomospecies are considered pathogenic for humans: B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii and B. garinii. One of the indicators, that enables us to estimate the LD risk for humans in the natural foci, is the estimation of borrelial prevalence in the tick vector. Ixodes ricinus ticks were collected by flagging at approximately monthly periods from May to November 2006 and in March 2007 on three localities in southern Moravia (Czech Republic). All the localities represent popular recreational sites. The ticks were examined by dark-field microscopy (DFM) and PCR with primers specific for the whole complex Borrelia burgdorferi s.l. PCR positive samples were tested by species-specific PCR for the 3 genomospecies considered pathogenic for humans. Tick population density fluctuated seasonaly and between the localities. A part of the nymphs (285) was examined by DFM and another part (240) by PCR in pools of three or five individuals. The adults (100) were longitudinally dissected with a sterile lancet and a half of each individual was examined by DFM, the other half by PCR. The prevalence of borreliae in nymphal I. ricinus detected by DFM (9,7 %) differed significantly from the prevalence by PCR (3,3 %). In the case of adults the prevalence in ticks reached 18 % by DFM and 23 % by PCR. 12 % of the samples were positive by both methods, 6 % were positive by DFM and negative by PCR, 11 % were negative by DFM and positive by PCR, and 71 % were negative by both methods. The difference in the sensitivity of PCR between nymphs and adults was probably caused by the inhibition of PCR by the excess of tick derived DNA, which was bigger in the case of pools of nymphs, because it contained bigger numbers of ticks than the pools of adults. In 25 of 31 positive samples one of the three pathogenic genomic groups was identified. The most prevalent was B. garinii (33,3 %) and B. afzelii (35,9 %) less than B. burgdorferi s.s. (12,8 %). Simultaneous infection of one tick by B. afzelii and B. garinii was detected in one case (2,6 %).

Keywords

lymská borrelióza, Lyme disease, Borrelia burgdorferi, klíště, tick, PCR, PCR-RFLP, spirochéta, Ixodes ricinus, klíšťaty přenášená onemocnění

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 5. 2007

Thesis defence

• Date of defence: 15. 6. 2007
• Supervisor: prof. RNDr. Zdeněk Hubálek, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / General Biology