Značení DNA elektrochemicky aktivními skupinami a luminofory pro analýzu nukleotidových sekvencí

Mgr. Zdenka Dudová, Ph.D.

Doctoral thesis

DNA labelling with electrochemically active groups and luminophores for the analysis of nucleotide sequences

Abstract:

Tato práce je zaměřena na elektrochemické značení NK, studium interakcí DNA s jinými molekulami, a na využití elektrochemických metod k detekci jednonukleotidových polymorfismů (SNP). Dále jsme sledovali enzymatickou inkorporaci syntetických (modifikovaných) nukleosid trifosfátů do dlouhých řetězců DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), jejich vliv na stabilitu duplexu a obecné elektrochemické chování námi modifikované DNA. Současně jsme se zabývali podstatou interakcí DNA modifikované 7-deazaguaninem se Sybr Green I (SG), což je běžně používané fluorescenční barvivo pro detekci dvouřetězcové DNA, ale v přítomnosti 7-deazaguaninu (G*) je jeho fluorescence zhášena. Byla provedena optimalizace spektroskopického i elektrochemického stanovení interakce SG s nemodifikovanou i G*-modifikovanou DNA a bylo ukázáno, že SG se na modifikovanou DNA váže stejně jako na nemodifikovanou DNA. V neposlední řadě je část této práce věnována elektrochemickým metodám detekce jednonukleotidových polymorfismů v cDNA genu p53 pomocí elektrochemické metody využívající enzymové amplifikace signálu. Jednotlivé problematiky se úzce prolínají a jejich principy jsou shrnuty v teoretické části práce. Na závěr jsou zde uvedeny a okomentovány výsledky publikované v zahraničních impaktovaných časopisech.

Abstract:

This work is focused on electrochemical labeling of NA, studying of interactions between DNA and other molecules and utilization of electrochemical methods for single nucleotide polymorphisms (SNPs) detection. There was studied enzymatic incorporation of synthetic (modified) nucleoside triphosphates into long strands of DNA by polymerase chain reaction (PCR) and the influence of such modifications on duplex stability and a its general electrochemical behavior in this work. Simultaneously, it was looking for a nature of the interaction of 7-deazaguanine (G*) modified DNA with SYBR Green I. Sybr Green I is a commonly used fluorescent dye for a detection of double-stranded DNA, but in the presence of G* is its fluorescence quenched. Spectroscopical and electrochemical determination of such interaction with unmodified or G*-modified DNA was optimized and the results showed that Sybr Green I interacts with both DNAs in the same way. Part of this work is devoted to electrochemical methods for detection of single nucleotide polymorphisms in cDNA p53 gene using enzymatic amplification reaction. Listed issues are closely interconnected and their principles are summarized in the theoretical part. In the end there is a part summarizes results published already in impacted scientific journals.

Keywords

DNA, elektrochemie, elektrochemické značení, detekce SNP, PCR, zhášení fluorescence, electrochemistry, electrochemical labeling, SNP detection, fluorescence quenching

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 9. 9. 2016
• Supervisor: Mgr. Hana Pivoňková, Ph.D.
• Reader: doc. Ing. Renáta Selešovská, Ph.D., doc. RNDr. Petr Pečinka, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Genomics and Proteomics