Molekulární diagnostika arytmogenních syndromů s využitím genomických metod

Mgr. Iva Synková, Ph.D.

Doctoral thesis

Molecular diagnostics of arrhythmogenic disorders with the use of genomic methods

Abstract:

Arytmogenní syndromy tvoří skupinu dědičných srdečních onemocnění, která jsou obecně definována absencí strukturálního onemocnění srdce a porušenými elektrickými procesy v srdečních buňkách. Jedná se o poměrně četná onemocnění v populaci, která jsou nebezpečná svou manifestací, protože prvním projevem onemocnění může být náhlé úmrtí nositele. Patřičná kardiologická vyšetření včetně molekulární diagnostiky asociovaných genů jsou proto klíčové pro stanovení rizika a terapie v postižených rodinách. Arytmogenní syndromy a konkrétně syndrom dlouhého QT intervalu byl v laboratořích Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Brno vyšetřován již od roku 2000. S vědeckým poznáním bylo s rozvojem různých arytmogenních syndromů od té doby asociováno již velké množství genů, a tak je nyní díky technologickému pokroku „zlatým standardem“ v diagnostice těchto chorob masivně paralelní sekvenování. V rámci této práce byla do rutinního vyšetřovacího procesu zavedena a optimalizována nová metoda přípravy sekvenační knihovny pro masivně paralelní sekvenování. Pro interpretaci detekovaných variant byla implementována pravidla a klasifikační systém navržený Americkou kolejí lékařské genetiky a genomiky s Asociací pro molekulární patologii, které jsou známé pod označením ACMG guidelines. S jejich využitím byly také reklasifikovány všechny nálezy u souboru 310 pacientů s diagnózou I49.8 - Jiné určené srdeční arytmie vyšetřených v letech 2000–2021. Pro analýzu spektra nálezů a posouzení výtěžnosti molekulárně genetické analýzy bylo nutné také přeposouzení diagnózy stanovené u pacientů indikovaných ke genetickému vyšetření. Pro statistickou analýzu výsledků byl nejvhodnější soubor 148 pacientů s vysokou pravděpodobností syndromu dlouhého QT intervalu, z nichž u 86 byla detekována varianta, která by mohla být asociována s patologickým fenotypem. Výsledky retrospektivní analýzy byly srovnatelné s výsledky podobných aktuálních studií. V souboru nálezů bylo 5 sekvenčních variant, které byly detekovány u vícero nepříbuzných rodin, z nichž 2 sekvenční varianty jsou velmi vzácné a nejsou běžně detekovány v populaci. Variantu c.926C>T v genu KCNQ1 sdílelo 10 rodin a variantu c.1686G>C sdílely 4 rodiny. U těchto rodin bylo haplotypovou analýzou s využitím STR i SNP markerů potvrzeno, že se jedná o tzv. founder mutaci a afektované rodiny tak mají společného předka. Další částí práce byla molekulárně genetická analýza panelu genů asociovaných s arytmogenními syndromy u souboru 45 zemřelých jedinců do 35 let věku, u kterých nebyla soudní pitvou objasněna příčina úmrtí. V tomto souboru bylo detekováno 29 variant nejasného významu, které by mohly být zodpovědné za úmrtí jedinců, avšak pro nedostatek důkazů nemohou být označeny jako patogenní nebo pravděpodobně patogenní. Ve srovnání s podobnými zahraničními studiemi jsme nebyli úspěšní v objasnění úmrtí pomocí molekulární pitvy, což může být dáno malým souborem vyšetřovaných vzorků. V průběhu řešení disertační práce byla prokázána efektivita molekulárně genetické analýzy s využitím metod masivně paralelního sekvenování u případů arytmogenních syndromů. S nárůstem detekce nových genetických variant jsou však spojeny vyšší nároky na jejich správnou interpretaci. Ta často naráží na časovou, technologickou i finanční náročnost funkčních analýz, které je nutné provádět pro objasnění molekulárního efektu detekovaných změn. I do budoucna proto bude nutné se vracet k dříve detekovaným variantám a reklasifikovat je na základě nových poznatků.

Abstract:

Arrhythmogenic disorders are a group of inherited heart diseases that are generally defined by the absence of structural heart disease and impaired electrical processes in heart cells. These are relatively common diseases in the population and are dangerous in their manifestation because the first manifestation of the disease may be sudden death of the carrier. Appropriate cardiological investigations, including molecular diagnostics of associated genes, are therefore crucial to determine risk and therapy in affected families. Arrhythmogenic syndromes, and specifically long QT interval syndrome, have been investigated in the laboratories of the Department of Medical Genetics at the University Hospital Brno since 2000. With scientific knowledge, many genes have been associated with the development of various arrhythmogenic syndromes since then, and thus, thanks to technological advances, massively parallel sequencing is now the "gold standard" in the diagnosis of these diseases. In this work, a new method of sequencing library preparation for massively parallel sequencing was introduced and optimized into the routine testing process. The rules and classification system proposed by the American College of Medical Genetics and Genomics with the Association for Molecular Pathology, known as the ACMG/AMP guidelines, were implemented to interpret the detected variants. All findings in a cohort of 310 patients diagnosed with I49.8 - Other specified cardiac arrhythmias examined between 2000 and 2021 were also reclassified using these guidelines. To analyze the spectrum of findings and to assess the yield of molecular genetic analysis, it was also necessary to reassess the diagnosis made in patients referred for genetic testing. For the statistical analysis of the results, the most appropriate group of patients was set of 148 patients with a high probability of long QT interval syndrome, of whom 86 had a variant that could be associated with a pathological phenotype. The results of the retrospective analysis were comparable to those of similar recent studies. The set of findings included 5 sequence variants that were detected in multiple unrelated families, 2 of which are very rare sequence variants that are not commonly detected in the population. The c.926C>T variant in the KCNQ1 gene was shared by 10 families and the c.1686G>C variant was shared by 4 families. In these families, haplotype analysis using STR and SNP markers confirmed that this is a founder mutation and the affected families share a common ancestor. The next part of the work was a molecular genetic analysis of a panel of genes associated with arrhythmogenic syndromes in a cohort of 45 deceased individuals under 35 years of age in whom the cause of death was not clarified by forensic autopsy. In this cohort, 29 variants of uncertain significance were detected that could be responsible for the deaths of the individuals but could not be identified as pathogenic or likely pathogenic due to lack of evidence. Compared with similar studies abroad, we were not successful in clarifying deaths by molecular autopsy, which may be due to the small sample set examined. During the dissertation, the effectiveness of molecular genetic analysis using massive parallel sequencing methods in cases of arrhythmogenic syndromes was demonstrated. However, the increase in the detection of new genetic variants is associated with higher demands for their correct interpretation. This often comes up against the time, technological and financial demands of the functional analyses that need to be performed to elucidate the molecular effect of the detected changes. In the future, it will therefore be necessary to revisit previously detected variants and reclassify them on the basis of new findings.

Keywords

Masivně paralelní sekvenování, Molekulární diagnostika, Arytmogenní syndromy, Srdeční kanálopatie, Syndrom prodlouženého QT intervalu, Náhlá srdeční smrt, Founder mutace, Haplotypová analýza, STR analýza, SNP analýza

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 1. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 4. 2. 2022
• Supervisor: RNDr. Iveta Valášková, Ph.D.
• Reader: RNDr. Jitka Kadlecová, Ph.D., doc. RNDr. Radek Vrtěl, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Molecular and Cell Biology and Genetics / Molecular and Cell Biology and Genetics