Diverzita bakterií rodu Bifidobacterium v trávicím traktu dětí s Crohnovou chorobou

Angelika Procházková

Bachelor's thesis

Diversity of the genus Bifidobacterium in the gastrointestinal tract of children with Crohn's disease

Abstract:

Crohnova choroba (CD) spadá do zánětlivých střevních onemocněních, jež mají negativní dopad na pacientův celkový zdravotní stav a jeho každodenní život. Toto onemocnění se vyznačuje dysbiózou gastrointestinálního traktu, kde je zvýšené množství patogenních mikroorganizmů a snížený počet komenzálů jako jsou bifidobakterie. Bifiidobakterie poskytují příznivý vliv na hostitele jako je ochrana proti patogenům, produkce pozitivních látek a trávení složitých látek. Podle literární rešerše dochází u pacientů s Crohnovou chorobou k redukci diverzity i kvantitativního zastoupení bifidobakterií.Tato bakalářské práce byla zaměřena na detekci a kvantifikaci bifidobakterií izolovaných z fekálních vzorků 11 dětí s CD odebraných ve spolupráci s nemocnicí Motol a analyzovaných na Katedře mikrobiologie, výživy a dietetiky (ČZU v Praze). Ke stanovení bifidobakterií byla použita desková kultivační metoda se dvěma variantami selektivních médií pro bifidobakterie za využití modifikovaného Wilkins-Chalgren agaru (WSP) s mupirocinem a kyselinou octovou (BIF-MUP) a totéž médium doplněno ještě o norfloxacin (BIF-NORF). Základní médium WSP bylo použito pro stanovení celkového počtu anaerobů. Narostlé kolonie byly spočteny a na základě kultivačních znaků kolonií bylo cílem získat alespoň celkem 12 izolátů pro další identifikaci. Získané izoláty byly rodově a druhově identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie (MALDI TOF MS).Z výsleků byla stanovena mikobiální diverzita izolovaných kolonií na selektivních agarech pro bifidobakterie a jejich počty u pacientů s CD. Bifidobakterie byly identifikovány pouze u 8 z 11 pacientů a zastoupení tohoto rodu činilo 51,18 % ze všech testovaných izolátů. Průměrné počty bifidobakterií izolovaných na selektivních médiích byly výrazně snížené (6,99 ± 1,45 log KTJ/g stolice na BIF-MUP a 6,40 ± 1,63 log KTJ/g stolice na BIF-NORF) ve srovnání se zdravými kontrolami, kde počty bifidobakterií dosahují hodnot 109 KTJ/g stolice. Rovněž byly u těchto pacientů identifikované i jiné mikrobiální rody (48,82 %), které by mohly působit dysbioticky či patogenně zvlášť u jedinců se sníženou imunitou. Na médiích pro bifidobakterie byly detekovány druhy jako Propionibacterium acnes, P. australiense, E. coli, Steptococcus pneumoniae, S. parasanguinis, S. sanguinis, S. oralis, Enterococcus faecalis, Candida albicans, C. glabrata, Clostridium difficile, Staphylococcus hominis, S. epidermidis a Bacillus cereus. Zároveň se díky nižšímu zastoupení bifidobakterií ve stolici podařilo vyizolovat zástupce rodu Bacteroides.Z výsledků této práce vyplývá snížená diverzita a kvantitativní zastoupení Bifidobacterium spp., což zjevně souvisí s dysbiotickým stavem jedinců s Crohnovou chorobou.

Abstract:

Crohn‘s disease (CD) belonging to inflammatory bowel diseases (IBD) has a negative impact on the pacient‘s overal health and his or her everyday life. This illness is characterized by its dysbiosis of gastrointestinal tract including higher quantities of pathogenic microogranisms and lower counts of benefitial commensals like bifidobacteria. Bifidobacteria have a positive effect on the host such as protection against pathogens, production of health-promoting substances and digestion of complex substances. According to literary research, patients with CD have reduced bifidobacterial diversity and even lowered quantitative representation.This bachelor theses was focused on the detection and quantification of bifidobacteria isolated from fecal samples of 11 children with CD collected in cooperation with Motol University Hospital and analysed at the Department of Microbiology, Nutrition and Dietetics (CULS Prague). Determination of bifidobacteria was carried out using the plate technique with two selective modified Wilkins-Chalgren agars (WSP) with mupirocin and acetic acid (BIF-MUP) and the same modified medium enhanced with norfloxacin (BIF-NORF). Nonselective WSP agar was applied for determination of the total count of anaerobes. Colonies grown on these agars were then counted and the objective was to attain at least 12 isolates selected based on their cultivation charasteristics. Acquired isolates were further identified on genus and species level using mass spectrometry (MALDI TOF MS).Results were used for the determination of microbial diversity of the colonies isolated on selective bifidobacterial agars and their counts in patients with CD. Bifidobacterium spp. was detected only in 8 out of 11 patients and representation of this genus was 51,18 % out of all tested isolates. Average number of isolated bifidobacteria were greatly lowered (6,99 ± 1,45 log CFU/g stool on BIF-MUP agar and 6,40 ± 1,63 log CFU/g stool on BIF-NORF) compared to the healthy control group, where the bifidobacterial numbers reached values of 109 CFU/g stool. Also other microbial genera were identified (48,82 %) in the pacients with CD and could act in dysbiotic way or as pathogens, especially in individuals with reduced immunity. On the bifidobacterial selective media were detected species including Propionibacterium acnes, P. australiense, Escherichia coli, Steptococcus pneumoniae, S. parasanguinis, S. sanguinis, S. oralis, Enterococcus faecalis, Candida albicans, C. glabrata, Clostridium difficile, Staphylococcus hominis, S. epidermidis and Bacillus cereus. Also beacuse of the reduced levels of bidifobacteria in the stool, there was a succesful isolation of representatives of the genus Bacteroides.Our results show that, there was reduced bifidobacterial diversity and quantitative representation. This is evidently connected with the dysbiotic state of individuals with CD.

Keywords

Crohnova choroba, bifidobakterie, identifikace, MALDI TOF MS, probiotika

Keywords

Crohn‘s disease, Bifidobacterium, identification, MALDI TOF MS, probiotics

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Věra Neužil Bunešová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / field:
Agriculture, Horticulture and Rural Development / Nutrition and Foodstuffs