Engineering of the synthetic metabolic pathway for biodegradation of an environmental pollutant

Mgr. Pavel Dvořák, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Tato práce popisuje využití metod syntetické biologie a metabolického inženýrství k racionálnímu redesignu metabolické dráhy pro biodegradaci důležitého environmentálního polutantu 1,2,3-trichlorpropanu (TCP). V úvodu práce jsou čtenáři přiblíženy nové technologie a přístupy pro inženýrství biosyntetických a biodegradačních drah společně s původem a počátky studia syntetické TCP dráhy. Dráha, která se skládá ze tří enzymů – halogenalkandehalogenasy, haloalkoholdehalogenasy a epoxidhydrolasy – pocházejících ze dvou různých mikroorganismů, dokáže přeměnit toxický TCP na neškodný produkt glycerol. Efektivita této přeměny je však negativně ovlivněna několika významnými limitacemi dráhy. Čtyři studie, které jsou shrnuty ve výsledkové části této práce, se snaží tato omezení popsat, racionálně optimalizovat fungování dráhy a připravit biokatalyzátor, který by mohl být využit k dekontaminaci míst znečištěných TCP. Kapitola 1 výsledkové části popisuje rekonstrukci modelové dráhy v podmínkách in vitro a vývoj nové biotechnologie pro transformaci TCP založené na imobilizovaných enzymech. Efektivita dráhy byla zvýšena zapojením halogenalkandehalogenasy s uměle zvýšenou aktivitou s TCP a dráha byla imobilizována v podobě purifikovaných enzymů či bezbuněčných extraktů. Výkon tříenzymového systému byl testován v třepaných lahvích i v průtokovém bioreaktoru. Tato studie je jedinou doposud publikovanou prací popisující využití imobilizované syntetické metabolické dráhy s enzymem upraveným proteinovým inženýrstvím pro biotransformaci toxické průmyslové odpadní látky na žádanou komoditní chemikálii. Dalšího zvýšení efektivity reakce může být dosaženo úpravou stechiometrie enzymů v dráze. Kapitola 2 popisuje vývoj pracovního postupu pro maximalizaci efektivity in vitro multienzymového procesu pomocí optimalizace stechiometrie. V této studii jsme využili kinetické modelování pro zlepšení efektivity tříenzymového systému založeného na in vitro rekonstruované TCP dráze. Matematické modelování podpořené laboratorními experimenty poskytlo detailní vhled do dynamického fungování dráhy, umožnilo výběr vhodného enzymu upraveného proteinovým inženýrstvím a přispělo tak k získání maximálního možného výtěžku finálního produktu glycerolu při využití minimálního potřebného množství enzymů. Studie zdůrazňuje potenciál kinetického modelování pro průmyslovou biokatalýzu a nabízí široce využitelnou strategii pro optimalizaci multienzymových procesů. Kapitola 3 se věnuje aplikaci dříve popsaného kinetického modelu v inženýrství TCP dráhy v heterologním hostiteli, bakterii Escherichia coli. TCP dráha byla sestavena v laboratorním kmeni E. coli BL21 (DE3) a tento ortogonální systém byl využit k důkladné analýze limitací dráhy v podmínkách in vivo. Za využití modifikovaného matematického modelu byly navrženy varianty dráhy s divokým typem halogenalkandehalogenasy i s mutanty připravenými proteinovým inženýrstvím. Byly zkonstruovány rekombinantní bakterie E. coli s optimalizovanou a neoptimalizovanou stechiometrií enzymů dráhy. Konstrukty byly experimentálně charakterizovány z pohledu jejich schopnosti degradovat TCP a přežít v jeho přítomnosti. Ověřený model byl použit ke kvantitativnímu popisu kinetických limitací v současnosti dostupných variant enzymů dráhy a k predikci dalších kroků nutných ke zlepšení limitních parametrů. Tato studie zdůrazňuje potenciál racionálního inženýrství mikroorganismů pro degradaci toxických látek antropogenního původu. Poslední kapitola výsledkové části, Kapitola 4, je zaměřena na popis přenosu TCP dráhy z laboratorního kmene E. coli BL21 (DE3) do robustního hostitele, bakterie Pseudomonas putid

Abstract:

a KT2440. Tato bakterie je přirozeně vybavena repertoárem metabolických a fyziologických funkcí, které ji dělají méně náchylnou ke stresu doprovázejícímu degradaci některých problematických látek včetně chlorovaných organických polutantů. Rozhodli jsme se přenést TCP dráhu do tohoto hostitele, abychom ověřili jeho použitelnost pro účely biodegradace TCP a dalšího vývoje dráhy pomocí in vivo evoluce. Studie popisuje přípravu syntetického operonu kódujícího enzymy TCP dráhy, jeho vnesení do chromosomu P. putida a základní charakterizaci vzniklých konstruktů. Získané rekombinantní bakterie budou dále charakterizovány a srovnány s konstrukty E. coli. V závěru kapitoly autor diskutuje možné budoucí směry dalšího inženýrství syntetické metabolické dráhy pro biodegradaci TCP. Tato práce tak prezentuje inovativní koncept racionálního inženýrství syntetické metabolické dráhy pro degradaci toxického environmentálního polutantu, založený na detailní znalosti studovaného biologického systému a využití in vitro, in silico a in vivo nástrojů syntetické biologie a metabolického inženýrství.

Abstract:

This Thesis describes the application of synthetic biology and metabolic engineering approaches for rational redesign of metabolic pathway for biodegradation of important environmental pollutant 1,2,3-trichloropropane (TCP). The emerging technologies for engineering of biosynthetic and biodegradation pathways are described in the Introduction of the Thesis and prologue to the origins of synthetic TCP route is provided. The pathway consisting of three enzymes – haloalkane dehalogenase, haloalcohol dehalogenase and epoxide hydrolase - from two different microorganisms can convert toxic TCP into harmless product glycerol but suffers from several important bottlenecks. The four studies described in the Results section of the Thesis aim at rational dissection of these handicaps, optimization of pathway performance and construction of biocatalyst utilizable for TCP removal from the contaminated sites. Chapter 1 of the Results section describes reconstruction of the model pathway in in vitro conditions and developing of a novel biotechnology for TCP transformation based on immobilized enzymes. The efficiency of the pathway was enhanced by employment of engineered haloalkane dehalogenase with improved activity toward TCP and the route was immobilized in the form of purified enzymes or cell-free extracts. The performance of the three-enzyme system was tested in batch and continuous operations. The study provides the first available report on the use of an immobilized synthetic metabolic pathway employing engineered enzyme for the biotransformation of the toxic industrial waste into desirable commodity chemical. Further improvement of the reaction efficiency can be achieved by tuning enzymes' stoichiometry. Development of the workflow for maximizing the efficiency of in vitro multi-enzyme process by stoichiometry optimization is addressed in Chapter 2. In this study, we employed kinetic modelling to maximize the efficiency of a three-enzyme system based on in vitro assembled TCP pathway. Mathematical modelling and one-pot multi-enzyme laboratory experiments provided detailed insight into pathway dynamics, enabled the selection of suitable engineered enzyme and afforded high yield of the final product glycerol, while minimizing biocatalyst loadings. The study highlights the potential of kinetic modelling for industrial biocatalysis and presents a broadly applicable strategy for optimizing multi-enzyme processes. Chapter 3 describes application of previously developed kinetic model for computer-assisted engineering of TCP pathway in heterologous host Escherichia coli. We assembled TCP route in the laboratory strain E. coli BL21 (DE3), and used it as an orthogonal biological system for thorough investigation of pathway bottlenecks in vivo. Variants of the pathway employing wild-type or engineered haloalkane dehalogenase were designed using modified mathematical model. The E. coli recombinants with optimized and non-optimized stoichiometry of pathway enzymes were constructed and characterized in terms of their viability in presence of TCP and degradation efficiency. The validated model was used to quantitatively describe the kinetic limitations of currently available enzyme variants, and to predict improvements required for further pathway optimization. The study highlights the potential of rational engineering of microorganisms for the degradation of toxic anthropogenic compounds. Last chapter of the Results section, Chapter 4, is focused on transfer of TCP pathway from laboratory strain E. coli BL21 (DE3) into robust heterologous host Pseudomonas putida KT2440, equipped with repertoire of metabolic and physiological functions that make it less susceptible to stress accompanying degradation of some problematic compounds including chlorinated organic pollutants. We decided to implant the TCP pathway into this host to verify its suitability for TCP biodegradation and further tuning of the synthetic route by in vivo evolution. Synthetic ope

Abstract:

ron encoding three enzymes from TCP pathway was assembled and introduced into P. putida chromosome. Obtained constructs will be further characterized and compared with their E. coli counterparts. The concluding section of the chapter discusses future directions in engineering of the synthetic metabolic pathway for biodegradation of TCP. In summary, the Thesis presents an innovative concept for rational engineering of a synthetic metabolic pathway for degradation of toxic recalcitrant compound based on detailed understanding of studied system and exploitation of in vitro, in silico and in vivo tools of synthetic biology and metabolic engineering.

Keywords

biokatalýza, biodegradace, kinetické modelování, metabolické inženýrství, imobilizace, in vitro multienzymová reakce, syntetická biologie, trichlorpropan

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 9. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 7. 11. 2014
• Supervisor: prof. Mgr. Jiří Damborský, Dr.
• Reader: prof. Ing. Tomáš Macek, CSc., RNDr. Karel Kyslík, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology