MALDI-TOF MS profilování bakterií ve spojení s proteolýzou za účasti mikrovln

Bc. Lucie Krištofová

Diplomová práce

MALDI-TOF MS profiling of bacteria combined with microwave-assisted proteolysis

Anotace:

V dnešní době je technika MALDI-TOF MS součástí každodenní identifikace bakterií v různých oborech, a to zejména díky své jednoduchosti, rychlosti a nízkým nákladům na jednotlivé analýzy. Všechny tyto vlastnosti dávají MALDI-TOF MS potenciál výrazně zlepšit mikrobiální diagnostiku. Kromě klinické mikrobiologie se tato technika dostává do popředí zájmu např. enviromentálních a potravinářských mikrobiologů. Princip spočívá ve vyhodnocení typického „fingerprintu“, který je charakteristický pro každý druh bakterie a skládá se z proteinových/peptidových signálů. Kromě bakterií lze identifikovat také kvasinky, archea, houby a viry. Tato diplomová práce se zabývá možnostmi zlepšení diferenciace příbuzných kmenů bakterií metodou MALDI-TOF MS použitím jednoduché varianty techniky spočívající ve vystavení bakteriálních buněk proteolytickým enzymům za působení mikrovln. Cílem bylo získání hmotnostních spekter, na základě kterých by bylo dosaženo zlepšení diskriminačních schopností metody a umožněno tak poddruhové a kmenové rozlišení. V rámci optimalizace byly vybrány tři proteázy schopné rychlé proteolýzy a zvoleny podmínky, při kterých bylo získáno nejvíce signálů v získaných hmotnostních spektrech. Vyvinuté metody byly pak dále testovány na osmi kmenech druhu S. aureus a na 32 kmenech S. petrasii. Na základě úspěšného rozlišení kmenů byla prokázána schopnost vyvinutých postupů modulovat diskriminační schopnosti MALDI-TOF MS profilování.

Abstract:

Nowadays MALDI-TOF MS is part of the routine identification of bacteria in different fields thanks to its simplicity, speed and low costs. All of these characteristics give MALDI-TOF MS the potential to enhance microbiological diagnostics. Apart from clinical mikrobiology,the methods increases its influence also in environmental and food microbiology. Its principle is based on the evaluation of a fingerprint, which is characteristic of every species of bacteria and consists of protein/peptide signals. Also other microorganisms are identifiable by this method – eg. yeasts, archea, fungi and viruses. This diploma thesis focuses on the differentiation of related bacterial strains using a simple variant of MALDI-TOF MS profiling, which consists in microwave-assisted enzymatic proteolysis of the bacterial cells. The goal was to obtain mass spectra enhancing the discriminatory power of the method allowing differentiation at the level of subspecies and strains. In the course of method optimization, three proteases capable of rapid proteolysis were selected and reaction conditions yielding the highest number of mass spectral signals were determined. The developed methods were tested on eight strains of S. aureus and on thirty-two strains of S. petrasii. Based of successful strain differentiation we conclude that the novel methods modulate the discriminatory power of MALDI-TOF MS profiling.

Klíčová slova

Hmotnostní spektrometrie, MALDI TOF MS, Staphylococcus aureus, Staphylococcus petrasii, profilování bakterií, proteolýza, diferenciace kmenů, trypsin, subtilisin, pepsin, mikrovlny Mass spectrometry, bacteria profiling, proteolysis, strain level differentiation, microwaves

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 5. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 14. 6. 2016
• Vedoucí: Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Experimentální biologie / Speciální biologie