Metodické přístupy k vyšetření lymfoidních tkání jeseterů

MUDr. Eva ŠÁLKOVÁ

Doctoral thesis

Methodical approaches to examination of lymphoid tissues in sturgeons

Abstract:

Předkládáme výsledky studií, které byly získány v průběhu doktorského studia a jsou shrnuty v disertační práci. Výzkum se zaměřil se posouzení různých metodických přístupů při vyšetřování lymfoidních tkání u jeseterů. Jeseteři se na Zemi vyskytují již více než 200 milionů let. Přežití do současnosti jim umožnil dobře vyvinutý a fungující obranný systém, zajišťující odolnost vůči mnohým negativním faktorům. Jeseteři jsou známí poměrně velkým genomem a náchylností k polyploidizačním událostem. Je známo, že v evoluci jeseterovitých ryb se uskutečnily tři celogenomové duplikace, označované jako 3R hypotéza (3 rounds hypothesis). Na základě této znalosti je možno jeseterovité ryby členit do různých ploidních skupin, s tím pak souvisí i rozdílné počty chromozómů u zástupců jednotlivých skupin. V naší práci jsme vyšetřili hematopoetické a lymfoidní tkáně u jeseterů. Studie byly prováděny na zástupcích jednotlivých ploidních úrovní: jeseter malý (Acipenser ruthenus) byl vybrán jako zástupce diploidní skupiny (2n), jeseter ruský (Acipenser gueldenstaedtii) jako zástupce tetraploidní (4n) a jeseter krátkorypý (Acipenser brevirostrum) jako představitel hexaploidní skupiny jeseterů (6n). U jesetera malého a jesetera krátkorypého jsme provedli histologické vyšetření hematopoetických a lymfoidních tkání. Tkáně byly klasicky zpracovány a obarveny hematoxylinem a eozinem. K bližší typizaci jednotlivých typů buněk jsme následně u vybraných tkání použili doplňující histologická barvení. Při vyšetření thymu jsme ve dřeni objevili Hassallova tělíska. Podle dostupných informací je naše sdělení považováno za první popis Hassallových tělísek v thymu jeseterů. Následovala studie, která se zabývala imunohistochemickým vyšetřením thymu juvenilního jesetera malého. K vyšetření jsme použili komerčně dostupné protilátky, běžně používané v humánní medicíně a diagnostice, konkrétně pak širokospektrý cytokeratin, vimentin, S-100 protein, leukocyte common antigen (LCA, CD45), CD3. Pozitivní výsledky jsme zaznamenali při vyšetření širokospektrého cytokeratinu, vimentinu a S-100 proteinu, zatímco vyšetření LCA a CD3 přineslo negativní nebo neprůkazné výsledky. Výsledky ukazují na možnost použití některých komerčně dostupných protilátek při vyšetřování tkání ryb, zároveň však poukazují na nutnost vývoje druhově a tkáňově specifických rybích protilátek. Hematologické vyšetření, především pak stanovení parametrů bílého krevního obrazu, představuje další z přístupů umožňující posouzení lymfoidních tkání u jeseterů. Odběr krve je ve srovnání s histologickým vyšetřením technicky jednodušší a dostupnější. Stanovení celkového počtu bílých krvinek a diferenciálního rozpočtu pak přináší důležité ukazatele celkového zdravotního stavu ryb. Naše studie se zaměřila na sledování parametrů bílého krevního obrazu a jejich změn v průběhu jednoho roku u zástupců tří různých ploidních úrovní jeseterů. Měsíčně jsme u deseti jedinců různých ploidních úrovní vyšetřili parametry bílého krevního obrazu. Získaná data ukázala, že ploidní úroveň ovlivňuje celkový počet leukocytů a podílí se na morfologických jaderných změnách granulocytů a lymfocytů. Naopak sezónní změny bílého krevního obrazu jsou závislé více na druhu jesetera a vlivech vnějšího prostředí než na ploidní úrovni. Vyšetření bílého krevního obrazu (stanovení celkového počtu leukocytů a diferenciálního rozpočtu) a histologické vyšetření tkání, a to včetně technicky náročnější imunohistochemie, představuje hlavní metodické přístupy při posuzování lymfoidních orgánů a imunitního stavu jeseterů. Metody mohou b

Abstract:

We present material, data and results that were encountered in doctoral study and summarized in dissertation thesis. Our research was focused on methodical approaches to examination of lymphoid tissues in sturgeons. Sturgeons live on Earth for a long period of time. Well-developed immune system enabled sturgeons to face and deal with different attacks, and thus played an important and crucial role in sturgeon survival until present days. Sturgeons exhibit large genomes among fishes and are well known for their polyploidy origin. Acipenseriformes have a high tolerance for hybridization as well as for spontaneous doubling of chromosome sets. In their evolution, at least three independent polyploidization events have taken place, in the literature known as 3R hypothesis (three rounds hypothesis). Therefore, the present research focused on the haematopoietic and lymphoid tissues examination. Representatives of different ploidy level groups were encountered in the study: sterlet (Acipenser ruthenus) represented diploid (2n) group, Russian sturgeon (Acipenser gueldenstaedtii) was chosen as tetraploid group representative (4n), and finally shortnose sturgeon (Acipenser brevirostrum) served as hexaploid group representative (6n). Haematopoietic and lymphoid tissues were conventionally histologically processed, obtained sections were stained using haematoxylin and eosin. Advanced histological staining methods were applied when examining tissues to map and recognize particular cell types involved in haemato- and lymphopoiesis. Hassall's corpuscles were detected in thymi, particular in the thymic medulla; to our knowledge, it was the first description of Hassall's corpuscles in sturgeons. Subsequently, the thymus of juvenile sterlet (Acipenser ruthenus) was examined immunohistochemically. The wide range cytokeratin, vimentin, S-100 protein, leukocyte common antigen LCA (CD45) and CD3 were selected as the markers to map the thymic microenvironment. Commercially available human antibodies were applied on fish tissue, and wide range cytokeratin, vimentin, S-100 protein brought conclusive results and distinguished nature of different microenvironmental components. Contrarily, LCA and CD3 application was negative or inconclusive, and failed. Study confirmed the possibility of human antibody application on fish tissue, together with the need to generate fish and species specific antibodies, mostly when examining lymphoid tissues. Except for the histological and immunohistochemical examination, respectively, the lymphoid or immune system should be tested when using the determination of white blood cell parameters. Generally, the blood is more easily accessible (vessel puncture), and the determination of the total number of leukocytes and the differential counts represent important fish health and physiology status. Under the study, representatives of three different ploidy level groups were tested and white blood cell parameters were monitored monthly during a period of one year. Data suggested the significant effect of ploidy level on total number of leukocytes and morphological nuclear changes in granulocytes and lymphocytes. Annual variation in differential leukocyte counts depended on the species and influence of various external conditions rather than ploidy level. Examination of white blood cell parameters (total number of leukocyte and differential count), as well as histological and immunohistochemical examination, respectively, represent the main methodical approaches for lymphoid organs and immune system assessment in sturgeons. Methods should be applied in an ichthyological practise. Obtained results contribute to fish health status evaluation.

Abstract:

ýt používány v ichtyologických laboratoří a výstupy jednotlivých vyšetření představují důležité ukazatele při posuzování celkového zdravotního stavu ryb.

Keywords

Acipenser brevirostrum, Acipenser gueldenstaedtii, Acipenser ruthenus, Hassallova tělíska, histologické vyšetření, imunohistochemie, lymfatická tkáň, thymus, ukazatele bílého krevního obrazu

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 31. 8. 2021

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Martin Flajšhans, Dr. rer. Agr.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery