Interakce spermií a jiker u sladkovodních ryb: vliv prostředí na fertilizační proces

MSc. Vitaliy KHOLODNYY, Ph.D.

Doctoral thesis

Sperm/egg interaction in freshwater fish: influence of environment on fertilization process

Abstract:

K oplození u sladkovodních ryb dochází v prostředí, které může negativně ovlivnit gamety. Z tohoto důvodu by se samčí gamet ryb měly co nejdříve dostat ke svému protějšku, samičí gametě, protože sperma se během osmotického šoku poškodí během několika minut nebo méně. Za těchto podmínek by bylo velmi výhodné, kdyby existoval specifický mechanismus, který by spouštěl, podporoval a řídil vzájemné setkání obou gamet. Jikry mnoha druhů sladkovodních ryb s vnějším oplozením jsou uvolňovány do vnějšího prostředí obklopené pláštěm ovariální tekutiny (OT) se složením ideálním pro podporu a ochranu jiker a spermatu před škodlivým účinkem sladké vody. Stávající data podporují myšlenku, že vlastnosti OT a/nebo specifických sloučenin obsažených v ní nebo uvolněných jikrami by mohly významně ovlivnit chování samčích gamet a následně ovlivnit výsledek oplodnění z hlediska počtu oplodněných oocytů. Mechanismy, které by usnadňovaly a spouštěly setkání gamet, jsou také velmi žádoucí, pokud jde o přirozený výběr. Zjistili jsme, že přítomnost OT významně ovlivnila chování spermií pstruha duhového, zejména znaky pohyblivosti spermií: vyšší rychlost byla udržována po delší dobu a trajektorie spermatu byly lineární, ve srovnání s těmi pozorovanými ve vodě. V testu akumulace spermií s mikro kapilárami (test chemotaktické reakce) ovariální tekutina pstruha duhového vykazovala "přitažlivý" účinek na aktivované samčí gamety, který závisel na osmotických vlastnostech aktivačního média. Různé frakce o různé molekulové hmotnosti OT ovlivňovaly "přitažlivé" chování buněk různým způsobem. Nejvýznamnější účinek zachytávání byl odhalen u nízkomolekulární frakce a bylo zjištěno, že možné chemotaktické činidlo je termostabilní. Zachycené buňky vykazovaly specifické chování tzv. turn-and-run, jenž je doprovázené asymetrickým pohybem bičíku a výbušným zvýšením koncentrace iontů vápníku v ohýbané části bičíku. In vitro fertilizační test odhalil zvýšení výkonu spermií, zejména ve vzorcích od příbuzných jedinců, což vedlo ke zvýšení míry vývoje embryí. Přítomnost ovariální tekutiny o zředěné koncentraci (30% roztok ve vodě) měla inhibiční účinek na iniciaci motility u jesetera malého. Nižší koncentrace ovariální tekutiny zvýšila životnost spermií a neovlivnila jejich trajektorie. Test chemotaktické odpovědi neprokázal žádný účinek ovariální tekutiny na chování spermií, zatímco současně byl patrný přitažlivý účinek roztoku inkubovaného jikrami (např. kvůli některým látkám uvolňovaných z jiker během jejich kontaktu se sladkou vodou). Výsledky in vitro fertilizačního testu ukázaly, že přítomnost ovariální tekutiny brání jikrám ve ztrátě fertilizační schopnosti v důsledku kontaktu s vodou, a také podporuje spermie, aby mohly oplodnit jikry během delší doby. Přítomnost ovariální tekutiny u kapra obecného v aktivačním médiu způsobila snížení rychlosti spermií ve srovnání s médiem prostým OT a významně změnila vzorec pohybu z přímé motility pozorované ve vodě na krouživý pohyb v médiu s vysokým obsahem OT (50%). Vpichování OT (v testu akumulace spermií) znamenalo okamžitou a výraznou chemotaktickou reakci spermií. Okolní podmínky, které doprovázejí setkání gamet, zejména přítomnost OT, obsah iontů vápníku a osmolarita, významně ovlivňují výkonnost samčích gamet u pstruha duhového, jesetera malého a kapra obecného, pokud jde o změny rychlosti, linearitu trajektorie a schopnosti reagovat na externí signály, např. atraktanty. Díky této provedené studii můžeme usuzovat, že způsob, jakým ovariální tekutina ovlivňuje chování spermií u těchto druhů, může být spojen s jejich reprodukční

Abstract:

Fertilization of fresh water fish occurs in an environment which may affect negatively the gametes, therefore the fish male gametes should reach their counterpart, the female gamete, as soon as possible because spermatozoa become damaged within minutes or less due to osmotic shock. Existence of specific mechanism triggering, supporting and guiding the encounter of gametes would be highly expedient in these conditions. The eggs of many externally fertilizing freshwater fish species are released into the external milieu surrounded by a coat of ovarian fluid (OF) with a composition ideal for supporting and protecting eggs and sperm against the deleterious effect of freshwater. The existing data support the idea that the properties of OF and/or the specific compounds contained in it or released by the eggs could significantly affect the behavior of male gametes and consequently influence the outcome of fertilization in terms of the number of fertilized oocytes. The mechanisms which facilitate and trigger gametes' encounter are also highly demanded in terms of natural selection. It was found that presence of OF affected significantly the behavior of rainbow trout spermatozoa, in particular, their motility traits: higher velocity was supported for longer time and trajectories were straightened, comparing to those observed in water. In the microcapillary spermatozoon accumulation test (test of chemotactic response) the rainbow trout OF showed a trapping effect on activated male gametes which depended on osmotic properties of the activating media. Different molecular weight fractions from OF affected the tactic behavior of the cells in a various way. The most significant trapping effect was rendered by low molecular fraction and the possible chemotactic agent was found to be thermostable. The trapped cells showed specific turn-and-run behavior accompanied by asymmetric bending of flagella and burst-like increase of calcium concentration in the bended area. The in vitro fertilization test revealed the enhancement of spermatozoa performance, especially in the samples from the related individuals, which led to the higher embryo development rate. Presence of particular concentration of ovarian fluid (30% solution in water) had inhibiting effect on sterlet spermatozoa motility initiation. Lower concentrations of the ovarian fluid improved the longevity of spermatozoa and did not affect their trajectories. Test of chemotactic response showed no effect of ovarian fluid on spermatozoa behavior, while at the same time the attracting effect of egg conditioned medium was evident (i.e. due to some substances released from the eggs during their contact with fresh water). The results of in vitro fertilization test showed that presence of ovarian fluid prevented the eggs from losing the fertilizing ability due to the contact with water, as well as promoted the spermatozoa to fertilize the eggs during longer period of time. Presence of common carp ovarian fluid in the activation medium caused the decrease of the velocity of spermatozoa comparing to the OF-free medium and significantly altered the motility pattern from straightforward motility observed in the water to the tumbling in the medium with high OF content (50%). Introduction of OF (in the sperm accumulation test) entailed immediate and prominent chemotactic-like reaction of spermatozoa. The environmental conditions which accompany the encounter of gametes, in particular presence of OF, calcium ion content and osmolarity, significantly affect the performance of male gametes in spermatozoa in rainbow trout, sterlet and common carp in terms of changes in velocity, path linearity and ability to response to the external signals, e.g. attractants. The conducted study allowed to conclude that way how the ovarian fluid affects the behavior of spermatozoa in these species may be associated with their reproduction (spawning) strategy.

Abstract:

(výtěrovou) strategií.

Keywords

pohyblivost spermií, gamety, rozmnožovaní, ovariální tekutina, chemotaxe, navádění, Oncorhynchus mykiss, Acipenser ruthenus, Cyprinus carpio

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 9. 2020

Thesis defence

• Supervisor: MSc. Serhii Boryshpolets, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery