Príprava a analýza transgénnych línií jačmeňa exprimujúcich rekombinantný katelicidín pod kontrolou konštitutívneho či zrnovo špecifického promótoru

Mgr. Alžbeta MIČÚCHOVÁ

Master's thesis

Preparation and analysis of transgenic barley lines expressing recombinant cathelicidin under the control of constitutive or grain specific promoter

Abstract:

Antimikrobiálne peptidy predstavujú esenciálne komponenty vrodeného imunitného systému pravdepodobne všetkých živých organizmov. Tieto peptidy sú považované za liečivá novej generácie, a to vďaka svojmu širokospektrálnemu účinku a minimálnej cytotoxicite voči cicavčím bunkám. Principiálnou prekážkou pre ich komerčné uplatnenie je však vysoká výrobná cena produktu. Rekombinantné technológie s využitím intaktných rastlín pre ich produkciu, tzv. rastlinné molekulárne farmárčenie, poskytuje oproti ostatným produkčným systémom celú radu výhod vrátane teoreticky neobmedzenej produkčnej kapacity za relatívne nízku cenu. V rámci diplomovej práce boli pripravené transgénne rastliny jačmeňa s integrovaným transgénom kódujúcim chimérny antimikrobiálny peptid v jačmennom genóme. Transgénita línií jačmeňa bola overená pomocou PCR a následne bol určený stupeň ploídie pomocou prietokovej cytometrie. U diploidných GMO rastlín bol metódou Southern blot určený počet integrácií transgénu do genómu jačmeňa. Prítomnosť rekombinantného peptidu na proteínovej úrovni bola overená metódou Western blot. Taktiež bola potvrdená antimikrobiálna aktivita rekombinantného peptidu voči nepatogénnej baktérii. Záverom bola vysadená T1 generácia transgénnych línií jačmeňa pre následné analýzy.

Abstract:

Antimicrobial peptides are essential components of the innate immune system of probably all living organisms. These peptides are considered as new generation antibiotics due to their broad spectrum activity and minimal cytotoxicity towords mammalian cells. However, high production costs represent the main obstacle for their commercialization. Recombinant technology based on the use intact plants for AMPs production, so-called the plant molecular pharming, provides number of advantages over other production systems including theoretically unlimited production capacity for relatively low costs. During the research for diploma thesis, T0 generation of transgenic barley plants (Hordeum vulgare L.) harbouring transgenes coding for chimeric antimicrobial peptide were prepared. The transgenity of the barley lines was verified by PCR and then ploidy level was determined by flow cytometry. For diploid GMO plants, the number of transgene integrations into the barley genome was verified by Southern blot analysis. Presence of recombinant peptide on the protein level was verified by Western blotting. Furthermore, the antimicrobial activity of recombinant peptide against non-pathogenic bacteria was confirmed. Finaly, transgenic barley lines harboring one or two transgenes integration were propagated in the T1 generation for further analysis.

Keywords

biofarmaceutiká, antimikrobiálne peptidy, jačmeň siaty (Hordeum vulgare L.), Agrobacterium tumefaciens, stabilná transformácia, antimikrobiálna aktivita

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 29. 5. 2017
• Supervisor: Mgr. Edita Holásková

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry