Telomery a telomeráza v rostlinách vystavených genotoxickému stresu

Bc. Martin Lyčka

Diplomová práce

Telomeres and telomerase in plants exposed to genotoxic stress

Anotace:

Kadmium je významným polutantem, který má řadu negativních efektů na buňku. Jedná se například o tvorbu reaktivních forem kyslíku, DNA zlomů a chromozomových aberací. Několik studií na savcích rovněž poukázalo, že kadmium indukuje zkracování telomer, zvýšení aktivity telomerázy a zvýšenou transkripci genu TERT, genu pro katalytickou podjednotku enzymu telomerázy. Nicméně v případě rostlin jsou dosavadní poznatky působení kadmiového stresu na telomery a telomerázu značně limitovány. Teoretická část diplomové práce sumarizuje základní poznatky o kadmiu s důrazem na jeho vliv na telomery a telomerázu. Dále jsou shrnuta základní fakta o fytochelatinech, telomerách a telomeráze. Experimentální část je zaměřena na určení vlivu kademnatých solí CdSO4 a CdCl2 na délku telomer, aktivitu telomerázy a její transkripci, na obsah fytochelatinů a na histonové modifikace telomerového chromatinu v modelových rostlinách Arabidopsis thaliana a Nicotiana tabacum (v klíčních rostlinách, listech a kalusech) a v tabákové suspenzní kultuře BY-2. V rámci této práce bylo zjištěno, že působením Cd2+ dochází k morfologickým změnám v kalusové kultuře N. tabacum. Dále se prokázalo zvýšení aktivity telomerázy v klíčních rostlinách A. thaliana vystavených Cd stresu, zatímco u klíčních rostlin N. tabacum se projevil opačný efekt. V případě třídenní kultury BY-2 vystavené Cd stresu nebyla pozorována žádná změna aktivity telomerázy. Pilotní experimenty rovněž naznačují, že samotné ionty Cd2+ ovlivňují aktivitu telomerázy v in vitro analýze. Analýza délky telomer ve vzorcích A. thaliana ukázala, že kadmium nemá výrazný vliv na délku telomer s výjimkou starých kalusů, jež byly 4 měsíce kultivovány na médiu s 50 µM CdCl2 a následně navráceny zpět na kontrolní médium. U klíčních rostlin a kalusů obou druhů rostlin a kultury BY-2, které byly vystaveny Cd stresu, bylo pozorováno zvýšení množství fytochelatinů, přičemž v případě N. tabacum bylo toto množství výrazně nižší oproti vzorkům A. thaliana. V případě tabákové suspenzní kultury BY 2 kultivované pět dní v přítomnosti Cd2+ iontů se neprokázala oligonukleozomální fragmentace DNA, která byla pozorována v předchozí studii. Cd stres měl také vliv na epigenetický stav telomerového chromatinu, přičemž efekt se lišil, jak v rámci druhu rostliny, tak rostlinného pletiva. Měření transkripce genů kódujících proteinovou podjednotku telomerázy a telomerázovou RNA neposkytlo relevantní data v důsledku velké interindividuální variability mezi biologickými replikami. Získané výsledky naznačují, že oblast telomer a telomeráza jsou, stejně jako v případě savců, výrazně ovlivňovány přítomností Cd2+ iontů.

Abstract:

Cadmium is a significant pollutant, which has many negative effects on the cell. These include the formation of reactive oxygen species, DNA breaks and chromosomal aberrations. Several studies on mammals also pointed out the telomere shortening, increased telomerase activity and the upregulation of the expression of TERT, the catalytic subunit of the enzyme telomerase, in response to the cadmium treatment. However, in the case of plants the current knowledge about effects of cadmium stress on telomeres and telomerase is limited. In the theoretical part of the diploma thesis, basic knowledge on cadmium with the emphasis on its effect on telomeres and telomerase is summarized. Next, basic facts about phytochelatins, telomeres and telomerase are presented. The experimental part focuses on analyses of telomere length, telomerase activity and transcription, phytochelatin content and histone modifications of telomeric chromatin in the model plant Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum (seedlings, leaves and calli) and tobacco suspension culture BY-2 exposed to the cadmium stress. In this work, it was found out that the presence of Cd2+ in cultivation media induced morphological changes in the callus culture of N. tabacum. Furthermore, an increase of telomerase activity was observed in seedlings of A. thaliana while N. tabacum seedlings showed the opposite effect. No change of telomerase activity was observed in the BY-2 culture exposed to the Cd stress. In vitro initial experiments also indicate that Cd2+ ions alone affect the activity of telomerase. Length of telomeres was maintained in A. thaliana samples influenced by cadmium ions, except for the old calli that were cultured in the presence of 50 µM CdCl2 for 4 months and subsequently returned to the control medium; in this sample telomere shortening was detected. In seedlings and calli of both plant species and tobacco culture BY-2 subjected to Cd stress, an increase of the amount of phytochelatins was observed. In the case of N. tabacum, the amount of phytochelatins was substantially lower compared to the samples of A. thaliana. In contrast to the previous study, oligonucleosomal fragmentation of DNA was not observed in cadmium-treated tobacco BY-2 culture. Cd stress also impacted the epigenetic state of telomeric chromatin; the effect was dependent on both plant species and type of the plant tissue. In analysis of the transcription of genes coding for telomerase protein subunit and telomerase RNA, high interindividual variability between biological replicates was observed, thus these data were not suitable for statistical evaluation. Obtained results suggest that telomere and telomerase are, as in mammals, significantly affected by the presence of Cd2+ ions.

Klíčová slova

telomery, telomeráza, TER, TERT, kadmium, fytochelatin, telomeres, telomerase, cadmium, phytochelatin

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 5. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 6. 2017
• Vedoucí: doc. Mgr. Miloslava Fojtová, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Genomika a proteomika