Microfluidics for the analysis of biologically important substances

Mgr. Roman Tomáš, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Tato dizertační práce se zabývá on-line spojením separačních technik, především isoelektrické fokusace a izotachoforézy s hmotnostním spektrometrem s ionizací elektrosprejem. Zařízení MicroRotoforTM bylo využito pro isoelektrickou fokusaci tryptických digestů cytochromu C, myoglobinu, hovězího sérového albuminu a β-caseinu. Hlavní část zařízení byla tvořena fokusační celou o celkovém objemu 2,5 ml, mechanicky rozdělenou polyesterovými membránami do deseti oddělení. Fokusace byla prováděna ve dvou základních módech – jako autofokusace bez použití amfolytů, nebo s pH gradientem tvořeným pomocí komerčních amfolytů. Systém sloužil pro zjednoduššení vzorku před další analýzou zónovou elektroforézou a identifikací na hmotnostním spektrometru s ionizací elektrosprejem. Měření na hmotnostním spektrometru ukázalo značné potlačení signálu analytu v důsledku použití komerčních amfolytů a autofokusační mód vykázal vyšší potenciál pro identifikaci peptidů. Druhá část práce se věnuje analýze kationtů, především vitamínů řady B z krve a moči a analýze tryptických digestů hovězího sérového albuminu, cytochromu C a myoglobinu izotachoforézou on-line spojenou s hmotnostním spektrometrem s ionizací elektrosprejem. Izotachoforetický systém byl modifikován pro využití tlaku uvnitř systému a byl doplněn o bifurkační blok umožňující on-line spojení obou technik. Systém byl tlakován stříkačkovou pumpou a zakoncentrované vzorky byly z bifurkačního bloku hydrodynamicky transportovány křemennou kapilárou s vnitřím průměrem od 10-75µm ke sprejovací špičce. Systém byl navržen pro rychlou analýzu biologických vzorků bez nutnosti jakékoli předúpravy a s vysokým stupněm zakoncentrování. Vzorky moči i krve byly do systému dávkovány bez předchozí úpravy, pouze s minimálním zředěním. Limit detekce byl stanoven v řádu 10-10M.

Abstract:

This work is focused on on-line coupling of separation techniques, especially isoelectric focusing and isotachophoresis with electrospray mass spectrometry A multicompartment electrolyzer MicroRotoforTM was used for isoelectric focusing of tryptic digests of cytochrome C, myoglobin, bovine serum albumin and β–casein. The main part of MicroRotoforTM device was formed by focusing cell with total volume 2.5 ml divided into ten compartments by permeable polyester screens. Focusing process was performed either in autofocusing mode or with pH gradient formed by carrier ampholytes. The system served for sample simplification before zone electrophoresis and electrospray mass spectrometry identification. Mass spectrometry analysis showed high ion suppression in case of carrier ampholytes and autofocusing mode showed higher sequence coverage in peptide identification. The second part of this work is focused on cation analysis, especially analysis of B vitamins from blood and urine and tryptic digests of bovine serum albumin, cytochrome C and myoglobin by isotachophoresis on-line coupled with electrospray mass spectrometry. Isotachophoretic system was modified for use of pressure inside the system and bifurcation block was integrated enabling coupling of both techniques. System was pressurized by syringe pump and concentrated zones were hydrodynamically transported by fused silica capillary (10-75 µm i.d.) to spray tip. This system was designed for fast analysis of biological samples without need of any sample pretreatment with high preconcentration level. Blood and urine samples were injected without any pretreatment, only with minor dilution. LOD reached up to 10-10M.

Keywords

Isotachophoresis, isoelectric focusing, mass spectrometry, electrospray, proteins, peptides

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 8. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 5. 10. 2009
• Supervisor: Ing. František Foret, CSc.
• Reader: doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr., doc. Ing. Jan Fischer, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry (4-years) / Analytical Chemistry