Screening and in vitro construction of environmental biocatalysts

Mgr. Martina Pavlová, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Tato disertační práce prezentuje výsledky výzkumu zaměřeného na screening a in vitro konstrukci biokatalyzátorů pro degradaci halogenovaných alifatických uhlovodíků. Tyto chemické látky tvoří největší skupinu polutantů a jejich likvidace ze životního prostředí je důležitá pro dlouhodobě udržitelný rozvoj moderní společnosti. Bakteriální enzymy halogenalkandehalogenázy katalyzují kritický krok degradace řady halogenovaných alifatických sloučenin. Širší využití halogenalkandehalogenáz jako efektivních průmyslových a degradačních biokatalyzátorů je bohužel znesnadněno jejich nízkou aktivitou a omezenou substrátovou specifitou s cílovými polutanty. Metody proteinového inženýrství jsou proto použity ke konstrukci nových variant enzymů s vylepšenou katalytickou aktivitou a upravenou substrátovou specifitou. Vyhodnocení toxických a genotoxických efektů halogenovaných alifatických uhlovodíků je popsáno v Kapitole 1. Test somatických mutací a rekombinací s Drosophila melanogaster byl použit pro testovaní sady sedmnácti chemických sloučenin, obsahující chlorované, brómované, jodované, saturované a nesaturované uhlovodíky. Největší toxicita byla pozorována u skupiny nesaturovaných alifatických uhlovodíků a genotoxický efekt byl prokázán u 14 testovaných látek. Výsledky experimentů sloužily jako vstupní data pro QSAR analýzu. Výsledný QSAR model vysvětlil 81% (77% validované) kvantitativní variability dat. Deskriptory hydrofobicity, sterické deskriptory a elektronické deskriptory byly určeny jako nejvýznamnější. Nukleofilní superdelokalizace halogenu byla určující pro predikci toxicity a současně velmi důležitý parametr pro celkový popis škodlivého efektu halogenovaných látek na Drosophila melanogaster. Kapitola 2 je zaměřena na studium distribuce genů halogenalkandehalogenáz v mykobakteriích. Genom Mycobacterium tuberculosis a M. bovis obsahuje minimálně dva otevřené čtecí rámce kódující proteiny, který vykazují vysokou sekvenční podobnost s dříve biochemicky charakterizovanými halogenalkandehalogenázami. Geny pojmenované dmbA a dmbB byly naklonovány z M. bovis 5033/66 a jejich translační produkty testovány na dehalogenázovou aktivitu. PCR screening čtyřiceti osmi izolátů z různých hostitelů potvrdil širokou distribuci těchto genů mezi druhy M. tuberculosis komplex. Proteiny DmbA a DmbB byly heterologně exprimovány, purifikovány a biochemicky charakterizovány. Špatná exprese a nízká stabilita byla pozorována při heterologní expresi halogenalkandehalogenázy DhmA z Mycobacterium avium N85 v Escherichia coli. Kapitola 3 popisuje expresi DhmaA v nově zkonstruovaném rhodokokálním systému pK4RP. Tímto systémem se vylepšila exprese a současně i stabilita DhmA. Katalytická pentáda byla identifikovaná pomocí místně-cílené mutageneze a na základě výsledků byl předpověděn reakční mechanismus DhmA. V práci je diskutována evoluce katalytické pentády a molekulární adaptaci bakteriálních enzymů na syntetické substráty jako 1,2-dichlorethan. Inženýrství halogenalkandehalogenázy DhaA aktivnější s vysoce stabilní sloučeninou 1,2,3-trichlorpropanem je popsána v Kapitole 4. Mutantní varianty byly získány metodou řízené evoluce, která byla náhodně mutována klíčová místa enzymu. Racionální design odhalil velký význam aminokyselinových zbytků umístěným v přístupových cestách spojujících vnořené aktivní místo enzymu s vnějším prostředím. Byl zkonstruován mutant s významným 36-ti násobným vylepšením aktivity vůči 1,2,3-trichlorpropanu. Zvýšená rychlost štěpení 1,2,3-trichlorpropanu je pravděpodobně způsobena snížením přístupnosti molekul vody do aktivního místa enzymu podporující tvorbu aktivovaného komplexu. Tato studie současně navrhuje nový strategický p

Anotace:

řístup při úpravách katalytických vlastností enzymů inženýrstvím přístupových cest kombinující počítačové modelování a řízenou evoluci.

Abstract:

This Thesis presents the results of the research focused on the screening and in vitro construction of environmental biocatalysts, enzymes participating in degradation of halogenated aliphatic hydrocarbons. These compounds act as the largest group of pollutants and their decomposition in the environment is important for sustainability of a modern society. Microbial enzymes haloalkane dehalogenases are involved in dehalogenation of numerous halogenated aliphatic compounds which is a critical step of their degradation. Wider application of dehalogenases as efficient industrial or environmental biocatalysts is hindered by their relatively low activity and narrow substrate specificity towards target compounds. Protein engineering is being used for construction of new enzyme variants with improve catalytic activity or modified substrate specificity. The evaluation of halogenated aliphatic compounds for their toxicity and genotoxicity effects is presented in Chapter 1. The somatic mutation and recombination test employing Drosophila melanogaster was applied on the set of seventeen chemicals including chlorinated, brominated and iodinated, saturated and unsaturated hydrocarbons. The highest toxicity was observed for the group of unsaturated aliphatic hydrocarbons and the genotoxic effect was observed with 14 compounds. The experimental data served as input data for QSAR analysis. The QSAR model explained 81% (77% cross-validated) of the quantitative data variance. Hydrophobicity descriptors, steric descriptor and electronic descriptors were exploited by model as the most important. Nucleophilic superdelocalizability of the halogen atom was found to be important also for toxicity endpoint and seems to be a very good parameter for the description of overall harmful effects of halogenated chemicals to Drosophila melanogaster. Chapter 2 focuses on the study of distribution of haloalkane dehalogenase genes among mycobacteria. Genomes of Mycobacterium tuberculosis and M. bovis contain at least two open reading frames coding for the polypeptides showing a high sequence similarity with biochemically characterized haloalkane dehalogenases. The genes named dmbA and dmbB have been cloned from M. bovis 5033/66 and dehalogenase activity has been proven with their translation products. PCR screening of forty eight isolates from various hosts confirmed wide distribution of these genes among species of the M. tuberculosis complex. DmbA and DmbB proteins were heterologously expressed, purified to homogeneity and biochemically characterized. Haloalkane dehalogenase DhmA from Mycobacterium avium N85 showed poor expression and low stability when produced in Escherichia coli. Chapter 3 presents expression of DhmA in newly constructed pK4RP rhodococcal expression system in a soluble and stable form. The catalytic pentad was identified by site-directed mutagenesis and the reaction mechanism was proposed based on its composition. Evolution of catalytic pentad and molecular adaptation of bacterial enzymes towards the synthetic substrate 1,2-dichloroethane was discussed. The engineering of haloalkane dehalogenase DhaA to efficiently degrade recalcitrant compound 1,2,3-trichloropropane is described in Chapter 4. The mutants were obtained by using rational design for identification of key residues located in the access tunnels connecting the buried active site with bulk solvent and by directed evolution for randomisation of these residues. The mutant with a remarkable 36-times higher activity toward 1,2,3-trichloropropane than the natural enzyme was obtained. The enhanced rate with 1,2,3-trichloropropane appears to be due to decreased accessibility of the active site cavity for water molecules which promotes formation of an activated complex. This study proposes engineering of the access tunnels using computer-assisted protein design in combination with directed evolution as a valuable novel strategy for the alteration and improvement of the catalytic propertie

Abstract:

s of enzymes.

Keywords

biodegradation, halogenated aliphatic hydrocarbons, biocatalyst, in vitro construction, screening, mutagenesis, protein engineering

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 26. 1. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 19. 3. 2009
• Vedoucí: prof. RNDr. Jaroslav Koča, DrSc.
• Oponent: prof. RNDr. Luděk Bláha, Ph.D., doc. RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc., RNDr. Jiří Gabriel, DrSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Chemie (čtyřleté) / Chemie životního prostředí