Metody stanovení imunologických markerů technikou hmotnostní spektrometrie

Mgr. Eliška Benešová, Ph.D.

Doctoral thesis

Methods for quantification of immunological markers by mass spectrometry technique

Abstract:

Metody cílené hmotnostní spektrometrie se staly účinným nástrojem systémové biologie, farmaceutického výzkumu a v klinických aplikacích. Ve srovnání s imunoanalytickými metodami, standardně využívanými ke stanovení hladin proteinů, poskytuje kvantifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie několik výhod jako vysokou přesnost a správnost, opakovatelnost, selektivitu a možnost multiplexování. V proteomice typicky používaný bottom-up přístup využívá enzymatickou proteolýzu ke štěpení analyzovaného proteinu na peptidy. Pro přesnou a správnou kvantifikaci proteinů pomocí bottom-up přístupu je nezbytné správně zvolit interní standardizaci. V této disertační práce byly porovnány výsledky kvantifikace s využitím čtyř typů syntetických, isotopicky značených (SIL, synthetic isotopically labeled) peptidů prodloužených na C- nebo/a N-konci o sekvenci aminokyselin nebo značku odštěpenou v průběhu enzymatické proteolýzy. Výsledky ukazují, že SIL peptidy prodloužené o tři aminokyseliny na C- i N-konci dávají přesné a správné výsledky, srovnatelné s výsledky kvantifikace pomocí SIL proteinů, které jsou v kvantitativní proteomice považovány za ideální standardy. Hlavním cílem této disertační práce bylo vyvinout, optimalizovat a validovat multiplexové proteinové metody založené na hmotnostní spektrometrii v režimu monitorování vybraných reakcí (SRM, selected reaction monitoring) pro simultánní kvantifikaci klinicky relevantních imunologických markerů v různých matricích, aplikovat metody na vzorky novorozenců a matek z kohortové studie CELSPAC-TNG a korelovat proteomická data s daty z jiných omics disciplín (metabolomika, glykomika). Byla vyvinuta SRM metoda pro kvantifikaci zánětlivých proteinů kalprotektin 1 a 2, myeloperoxidáza, eozinofilní kationický protein, eozinofilní neurotoxin a α-1-antitrypsin a těžkých řetězců imunoglobulinů A1 a A2 ve vzorcích novorozenecké stolice. Dále byla vyvinuta SRM metoda pro kvantitativní profilování proteinů akutní fáze (APPs, acute phase proteins) sérový amyloid A1, sérový amyloid A2-izoforma 1, sérový amyloid A4, C-reaktivní protein, α-1-antitrypsin, α-1-kyselý glykoprotein 1 a 2 a těžkého řetězce imunoglobulinu A1 v suchých krevních kapkách (DBS, dried blood spots). Metoda byla aplikována k profilování APPs ve 134 vzorcích novorozeneckých DBS, současně s mikrobiálními metabolity tryptofanu a kynureninu. V neposlední řadě jsem vyvíjela metodu pro kvantifikaci devatenácti APPs a sedmi imunoglobulinů v pupečníkové plasmě a plasmě matek. Ve stejné sadě vzorků byl současně analyzován celkový uvolněný N-glykom a proteomické a glykomické data byla korelována.

Abstract:

Targeted mass spectrometry methods have become a powerful tool in systems biology, pharmaceutical research, and clinical applications. Compared to immunoanalytical methods, standardly used to determine endogenous protein levels, MS-based protein quantification provides several advantages, such as high quantitative accuracy, reproducibility, selectivity, sensitivity, and multiplexing capacity. Typically used bottom-up proteomic workflow applies enzymatic proteolysis to generate peptides as surrogate of target protein. To ensure precise protein quantification, the choice of the proper internal standardization is critical. This thesis aimed to compare the quantitative performance of four designs of synthetic isotopically labeled (SIL) peptides extended at C- or/and N-terminus with an amino acid sequence or a tag cleaved during enzymatic proteolysis. Results demonstrate that SIL winged peptides extended with three amino acids at both C- and N-termini have optimal quantitative performance, comparable with the SIL protein, the gold standard in quantitative proteomics. The primary aim of this thesis was to develop, optimize, and validate multiplex protein assays based on selected reaction monitoring (SRM) for simultaneous quantification of clinically relevant immune markers in different matrices, apply these assays to neonatal and maternal samples obtained from the CELSPAC-TNG birth cohort study, and correlate proteomic data with other -omics data sets (metabolomics, glycomics) to investigate the neonatal internal environment. A new multiplex SRM-based method for quantification of inflammatory proteins calprotectin 1 and 2, myeloperoxidase, eosinophil cationic protein, eosinophil-derived neurotoxin, and α-1-antitrypsin and adaptive immunity effectors immunoglobulin heavy constant A1 (IGHA1), and IGHA2 in neonatal stool swabs was developed. Next, an SRM-based assay for quantitative profiling of acute phase proteins (APPs) serum amyloid A1, serum amyloid A2-isoform 1, serum amyloid A4, C-reactive protein, α-1-antitrypsin, α-1-acid glycoprotein 1 and 2, and adaptive immunity effector IGHA1 in dried blood spots (DBS) was developed. The method was used to profile the APP levels in 134 samples of neonatal DBS in parallel with the profiling of microbial metabolites of the tryptophan and kynurenine pathways. Finally, I developed an SRM assay for quantifying nineteen APPs and seven immunoglobulins in umbilical cord plasma and corresponding maternal plasma. In the same set of samples, I analyzed the total released N-glycome and correlated proteomic data with glycomic data.

Keywords

proteomics, glycomics, N-glycans, liquid chromatography, mass spectrometry, absolute protein quantification, inflammatory markers, acute phase proteins, immunoglobulins

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 10. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 5. 12. 2023
• Supervisor: PharmDr. Zdeněk Spáčil, Ph.D.
• Reader: RNDr. Pavel Řehulka, Ph.D., Mgr. Zdeněk Kukačka, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Environmental Health Sciences / Environmental chemistry and toxicology