Efekty nízkomolekulárních PCB v plicních buněčných modelech

Bc. Lucie Svržková

Diplomová práce

Effects of low-molecular-weight PCBs in lung cell lines

Anotace:

Na rozdíl od vysokomolekulárních polychlorovaných bifenylů (PCB) nepocházejí nízkomolekulární kongenery, přítomné v ovzduší, z technických směsí. Jejich původem jsou nátěrové barvy a barvy využívané v průmyslu – barvení kosmetiky, časopisů, textilu, jídla atd. K expozici lidí dochází zejména inhalací nebo požitím. Jejich koncentrace ve vzduchu je vysoká zejména ve starších budovách, často ve školách a dalších veřejných institucích. V organismu snadno metabolicky konvertují a průběh biotransformačních reakcí často poskytuje reaktivní metabolity kyslíku (ROS). V této práci byly ve dvou lidských plicních buněčných liniích, A549 a HBEC3-KT, studovány efekty kongenerů nízkomolekulárních PCB: PCB 4, 8, 11, 18, 28, 31 a 52 (25 µM). Vzhledem k oxidativnímu metabolismu PCB se naše pozornost zaměřila na potenciální vznik oxidativního stresu, který by jej mohl doprovázet, v modelech plicních epiteliálních buněk. Produkce ROS byla v těchto buňkách nízká – některé PCB indukovaly ROS v krátkém expozičním čase 30 min a pouze PCB 8 generoval zvýšenou hladinu ROS také po 24hod expozici. Žádný ze studovaných kongenerů nevykazoval cytotoxicitu. Vysoká koncentrace PCB 8 (25 µM) indukovala po 6 hodinách signifikantně zvýšení hladiny 8 OH dG, markeru oxidativního poškození DNA, v buňkách A549, ale nikoliv v buněčné linii HBEC3-KT. Ani v jedné z těchto buněčných liniích nebyla po expozici PCB 8 zvýšena lipidní peroxidace (stanovena jako hladina 8-iso-prostaglandinu F2. Expozice nízkomolekulárními PCB nevedla k indukci exprese antioxidačního enzymu HMOX-1. PCB 8 a také PCB 52 indukovaly po 24hod expresi COX-2; tato indukce však nebyla spojena se zvýšenou biosyntézou prostaglandinů. PCB 4 indukoval po 3hod expresi COX-2 a IL-8; IL-8 byl také zvýšen po 3hod expozici PCB 18 nebo PCB 52. Dále byla stanovena transkripční aktivita aryluhlovodíkového receptoru (AhR), který kontroluje expresi CYP1 enzymů, zodpovědných za 1. fázi metabolismu PCB. Pouze PCB 31 parciálně indukoval CYP1A1, marker AhR-dependentní genové exprese. PCB 4 aktivoval v krátkém expozičním čase 30 min mitogenem aktiovované proteinkinasy ERK1/2 a p38. Všechny kongenery PCB s výjimkou PCB 31 aktivovaly ERK1/2 a p38 po 3hod expozici, ovšem relevance k možným toxickým efektům nízkomolekulárních PCB není doposud známa. Produkce ROS pravděpodobně nehraje velmi významnou roli v toxicitě nízkomolekulárních PCB; přesto naše data mohou indikovat možné mechanismy regulace ROS dependentní genové exprese těmito sloučeninami.

Abstract:

The low-molecular-weight polychlorinated biphenyls (PCBs) present in the air do not originate from technical mixtures unlike the high-molecular-weight congeners. They are produced as by-products during the commercial paints and pigments manufacturing. These paints and pigments are widely used in industry – the colouration of cosmetics, textiles, magazines, food etc. Inhalation or ingestion are the major ways of human exposure. The concentration of these compounds in the air can be significant especially in old buildings like schools and other public institutions. In the organism they convert easily and reactive oxygen species (ROS) are often formed during their biotransformation. In this study effects of these PCB congeners – PCB 4, 8, 11, 18, 28, 31 and 52 (25µM) were studied in two human lung cell lines, A549 and HBEC3-KT. Due to their oxidative metabolism we focused on the potential ROS formation in lung epithelial cell models. ROS production in these lung cells was low – several PCBs induced ROS formation after short exposure time 30 min, but only PCB 8 generated increased ROS levels after 24h exposure. None of studied congeners was cytotoxic. 6h exposure of high concentration of PCB 8 (25 µM) caused increased levels of 8-OHdG, a marker of oxidative stress, in A549 cells, but not in HBEC3-KT cell line. Lipid peroxidation was not observed in any of these cell lines (determined as the level of 8-iso-prostaglandin F2). Low-molecular-weight PCBs exposure did not lead to induction of antioxidant enzyme HMOX-1 expression. PCB 8 and PCB 52 induced COX-2 expression after 24h exposure, but it did not correlate with increased biosynthesis of prostaglandins. 3h exposure to PCB 4 increased level of COX-2 and IL-8; IL-8 was increased also after 3h exposure to PCB 18 and PCB 52 exposure. Next the transcriptional activity of aryl hydrocarbon receptor (AhR) was determined. AhR controls the expression of CYP1 enzymes responsible for the first phase of PCB metabolism. Only PCB 31 partially induced CYP1A1 expression, a marker of AhR dependent gene expression. Short 30min exposure of PCB 4 activated mitogen-activated protein kinases ERK1/2 and p38. All of used PCB congeners, except PCB 31, activated these protein kinases after 3h exposure, but the relevance of toxic effects of low-molecular-weight PCBs is not known yet. ROS production probably does not play a significant role in their toxicity; yet our data could indicate possible mechanisms of regulation of ROS dependent gene expression by these compounds.

Klíčová slova

nízkomolekulární PCB, ROS, oxidativní stres, qRT-PCR, průtoková cytometrie, western blotting, cytotoxicita, LC-MS/MS, low-molecular-weight PCBs, oxidative stress, flow cytometry, cytotoxicity

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 5. 5. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 6. 2016
• Vedoucí: RNDr. Miroslav Machala, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie