Telomerasa a RuvBL helikasy

Mgr. Šárka Schořová

Bachelor's thesis

Telomerase and RuvBL helicases

Abstract:

Telomery jsou nukleoproteinové komplexy na koncích lineárních chromozomů eukaryot. Chrání chromozomy před replikativním krácením. V somatických buňkách jsou telomery přirozeně zkracovány po celý život. Tento proces je projevem přirozeného stárnutí. Enzym telomeráza prodlužuje telomery přidáváním nukleotidů k nedokončenému opožďujícímu řetězci. Velkou aktivitou se telomeráza vyznačuje u embryonálních, kmenových a nádorových buněk. Neustále prodlužuje telomery chromozomů nádorových buněk a způsobuje tak jejich „nesmrtelnost“. Díky tomuto zjištění jsou telomery široce studovány ve spojitosti s rakovinným onemocněním. V komplexu proteinů interagujících s N-koncovými doménami proteinové podjednotky telomerázy (TERT) byly pomocí tandemové afinitní purifikace (TAP) v naší laboratoři mimo jiné vyizolovány také ATP-dependentní RuvBL helikázy. Jak název naznačuje, tyto proteiny mají ATPázovou a helikázovou funkci, které například v lidských buňkách ovlivňují aktivitu telomerázy. Cílem této práce je potvrdit nebo vyvrátit přítomnost protein-proteinových interakcí mezi RuvBL helikázami, nazývanými také pontin a reptin, a doménami RID1 a TEN proteinové podjednotky TERT. Nejdříve byly všechny proteiny naklonovány do příslušných vektorů pomocí Gateway technologie. Při sekvenaci proteinu RuvBL1 byl zjištěn výskyt četných mutací a proto byly další metody prováděny jen s proteinem RuvBL2. K ověření možných protein-proteinových interakcí byly použity metody - bimolekulární fluorescenční komplementace, kvasinkový dvouhybridní systém a imunoprecipitace. Pomocí prvních dvou metod nebyla potvrzena přímá interakce proteinu RuvBL2 s RID1 ani s TEN doménou rostlinné TERT. Při imunoprecipitaci byla použita IgG protilátka, která má téměř stejnou velikosti jako protein RuvBL2. Signály protilátky a RuvBL2 se překrývají a tak nelze jednoznačně říct, že je výsledek opět negativní jako u předešlých dvou metod. Avšak s přihlédnutím k výsledkům z předchozích metod, testům exprese a informacemi z článků lze říct, že protein RuvBL2 neinteraguje ani s RID1 ani s TEN doménou.

Abstract:

Telomeres are nucleoprotein complexes at the end of eukaryotic linear chromosomes. These complexes protect chromosomes from replicative shortening. Telomeres are naturally reduced in somatic cells. This process is called aging. Enzyme telomerase lengthens telomeres by adding nucleotides to incomplete lagging strand. Embryonic, tumor cells and stem cells have high telomerase activity. Telomerase permanently lengthens chromosomes of tumor cells and causes its „immortality”. Thanks to this discovery telomeres are widely studied in connection with tumors. By tandem affinity purification (TAP) a lot of proteins interacting with telomerase were obtained. Some of them were identified as ATP-dependent RuvBL helicases. They are characterized by having ATPase and helicase activity, which impacts telomerase activity in human cells. The main goal of this work was verification of protein-protein interactions between RuvBL helicases, also called pontin and reptin, and regions RID1 and TEN of TERT subunit. At first proteins were cloned into relevant vectors by Gateway technology. There were too many mutations during sequencing construct encoding RuvBL1 protein, so next methods were carried out with protein RuvBL2 only. We used three methods- bimolecular fluorescent complementation, yeast two hybrid system and immunoprecipitation. By the first two methods it was definitely found out that there is no direct interaction between protein RuvBL2 and RID1 or TEN domains of plant TERT. We used antibody with similar size as protein RuvBL2. Their signals overlap themselves so we can’t definitely say that RuvBL2 doesn’t interact with RID1 or TEN domain. But previous methods, test of expression and information from articles indicate that RuvBL2 doesn’t really interact with RID1 or TEN domain.

Keywords

telomery, telomeráza, TERT, TR, RuvBL helikázy, Arabidopsis thaliana

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 5. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 17. 6. 2013
• Supervisor: Mgr. Petra Procházková Schrumpfová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry