Zavedení vyšetření mutace V600E v genu BRAF v klinické laboratoři

Markéta VÍTKOVÁ

Bachelor's thesis

Introduction testing of mutation V600E in the BRAF gene in clinical laboratory

Abstract:

Rakovina kůže patří v dnešní době k velmi častým nádorovým onemocněním. Dokázáno je, že slunce a rakovina kůže spolu maximálně souvisí, a tak může postihnout kohokoliv, ale vyšší náklonnost vykazují lidé "světlých typů" s blonďatými nebo zrzavými vlasy, světlou kůží a velkým množstvím pih. Nejčastější lokalizace kožních nádorů je na místech, která jsou dlouhodobě vystavená slunečnímu záření oční víčka, nos, tváře, šíje, ramena a ruce. Nejčastějšími druhy rakoviny kůže jsou bazaliom, melanom a spinaliom. Cílem mé bakalářské práce bylo osvojení si teoretických poznatků ohledně rakoviny kůže, především o maligním melanomu. Maligní melanom se na rozdíl od ostatních epiteliálních nádorů jako je bazaliom nebo spinaliom nevyznačuje lokálním destruktivním růstem, ale nebezpečím časného hematogenního nebo lymfogenního metastazování. Maligní melanom metastázuje nejčastěji do lymfatických uzlin, ale vzdálené metastázy se mohou objevit i v kůži, plicích, mozku a gastrointestinálním traktu, převážně v tenkém střevě. Za biologickou příčinu maligního melanomu můžeme považovat přítomnost mutací. Jednou z nejvýznamnějších a nejvíce popisovaných mutací v souvislosti s maligním melanomem je mutace genu BRAF V600E, která se vyskytuje v pozici 1799 v oblasti kodonu 600. Mutace kodonu GTG>GAG vede k záměně valinu za kyselinu glutamovou. Aktivace mutovaného BRAF proteinu je výsledkem konformačních změn v jeho struktuře. Mutované V600E BRAF buňky nepodléhají apoptóze a stárnutí, což má za následek nekontrolovatelný replikační potenciál buněk. V600E BRAF mutovaný melanom pak uniká imunitní odpovědi organismu. V praktické části mé bakalářské práce bylo cílem osvojit si základní molekulárně biologické metody v genetické laboratoři. Především izolaci genomové DNA z bukálního stěru i periferní krve, přípravu a provedení PCR reakce, přípravu agarózového gelu a detekci PCR produktů pomocí gelové elektroforézy. Vyšetření mutace V600E v genu BRAF jsem prováděla pomocí metody PCR-ARMS. Principem této metody je použití čtyř různých primerů schopných detekovat mutovanou i nemutovanou sekvenci DNA během jednoho experimentu. Metodika byla převzata z práce Huang et al. (2013) a následně upravena pro potřeby laboratoře.

Abstract:

Nowadays, skin cancer belongs among very frequent tumor diseases. It has been proven that sun and skin cancer are maximally related, and thus it may affect everyone, however, ´light-type´ people having blonde or ginger-coloured hair, light skin and high numbers of freckles are much more likely to be affected. Skin tumors are most frequently localized in body areas that are exposed to sunshine in the long term, such as eyelids, nose, neck, shoulders and hands. The most frequent types of skin cancer are the following: Basaliom, Melanoma and Spinaliom. The aim of my bachelor thesis was to acquire theoretical knowledge about skin cancer, especially about the Malignant Melanoma. The Malignant Melanoma is, unlike the other epitelial tumors, such as Basaliom or Spinaliom, not characterized by local destructive growth, but by the danger of an early haematogenic or lymphogenic metastasis. The Malignant Melanoma often metastasizes into lymph nodes, however, distant metastases may also appear in skin, lungs, the brain and gastro-intestinal tract, mainly in the small intestine. The presence of mutations may be understood to be the biological cause of the Malignant Melanoma. One of the most significant and most described mutations (in connection to the Malignant Melanoma) is the BRAF gene V600E mutation, appearing in position No. 1799 in the area of codon No. 600. Codon GTG>GAG mutation leads to the exchange of valin for glutamic acid. Activating the mutated BRAF protein is a result of conformation changes within the protein structure. The mutated V600E BRAF cells are not subject to apoptosis and aging, the result of which is an incontrollable replicational potential of the cells. The mutated V600E BRAF Melanoma then escapes the organism´s immunity response. The aim of the practical part of my bachelor thesis was to acquire the basic molecularly biological methods in a genetic laboratory. Mainly isolating the genom DNA obtained from a buccal swab as well as peripheral blood, preparing and carriyng out a PCR reaction, preparing agarose gel, and detecting PCR products using gel electrophoresis. Mutation V600E within the BRAF gene examination was carried out via the PCR-ARMS method. The principle of this method relies in using four different primers able to detect both mutated and unmutated DNA sequence during one experiment. The methodology was taken over from Huang et al. (2013) and subsequently adapted to the needs of the laboratory.

Keywords

melanom, mutace, V600E, gen, BRAF, PCR-ARMS

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 8. 2017

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Dagmar Bystřická, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Studies

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Health Technician