Rozluštění mechanismu mnohokrokového fosforelaya signalizace v odpovědích na cytokinin a abiotický stres v rámci čeledi brukvovitých (Brassicaceae)

Katrina Leslie Chavez Malá

Disertační práce

Deciphering the mechanism of multistep phosphorelay signaling in cytokinin and abiotic stress responses within the Brassicaceae family

Anotace:

Vicekrokový přenos fosfátu (MSP) zprostředkovává přenos signálu v signálních drahách rostlinných hormonů a zároveň se účastní přenosu vnějších signálů z okolí rostlin včetně abiotických stresů. Zatímco role MSP v signalizaci cytokininů a odpovědi na abiotický stres u Arabidopsis thaliana je dobře zdokumentována, její role v ekonomicky významných plodinách z čeledi brukvovitých jako je řepka olejka (Brassica napus) a jejích předků Brassica rapa a Brassica oleracea zůstává nedostatečně prozkoumána. První část této práce objasňuje roli regulátorů odpovědi typu-A (RRAs), klíčových komponentů MSP. Zatímco RRAs jsou známy především jako negativní regulátory signální dráhy cytokininů, zde se soustředíme ja jjeich roli v odpovědích na abiotický stres u vybraných druhů rostlin z čeledi brukvovitých. Identifikovali jsme dosud necharakterizované ortology RRAs, které prokazují vysokou konzervaci na úrovni genové i proteinové struktury s ohledem na fylogenetickou příbuznost s Arabidopsis. Ošetření cytokininy prokázalo podobnou kinetiku odpovědi RRAs u vybraných druhů řepek jako u Arabidopsis. Vícenásobné porovnání aminokyselinových sekvencí DNA-vazebné domény GARP-like regulátorů odpovědi typu-B (RRBs) u řepek a A. thaliana odhalilo vysokou míru evoluční konzervace, což naznačuje podobné DNA vazebné motivy RRBs napříč čeledí brukvovitých. Analýza cis-regulačních prvků v promotorech RRA a cytokininová odezva MSP reportéru TCSv2:3XVENUS ppo transformaci do B. napus a B. rapa experimentálně potvrdila funkční podobnost transkripční regulace cytokininové odpovědi u studovaných druhů rostlin. Dále jsme pozorovali, že exprese RRA genů se mění v reakci na stres jako chlad nebo zasolení. Nicméně zatímco jsme nezískali jednoznačná data ukazující na regulaci RRA prostřednictvím transkripčních faktorů specifickýách pro stres, prokázali jsme,, že cytokininy hrají klíčovou úlohu v regulaci exprese RRA genů v podmínkách chladu u rostlin z čeledi brukvovitých. Druhá část práce zkoumá přirozenou variabilitu genů receptorů cytokininů u ekotypů Arabidopsis a jejich roli v adaptaci na stres. S využitím databáze 1001 Genomů byly vybrány ekotypy Arabidopsis thaliana s přirozeně se vyskytujícími variantami histidinových kináz AHK2, AHK3 a AHK4/CRE1 obsahujících jednonukleotidové polymorfismy (SNPs) v klíčových doménách receptorů. Vybrané ekotypy vykazovaly v testu prodlužování kořene změněnou citlivost na cytokininy pravděpodobně díky zvýšené aktivitě receptoru obsahující konkrétní SNP, nikoli však díky změně ve schopnosti vázat cytokininy. Odpovědi na stres ze sucha byly analyzovány pomocí automatizované platformy pro fenotypování rostlin (WIWAMxy). Prokázali jsme, že ekotypy s vyšší citlivostí na cytokininy byly schopny ve srovnání s Col-0 rozpoznat stres dříve. Vložení specificikých SNP do AHK4 vedlo ke změně odpovědi rostlin na cytokininy a zároveň k modulaci odpovědi na sucho, což potvrdilo zásadní roli přirozené genetické variability v MSP pro adaptaci rostlin na stres. Tato disertační práce tak poskytuje významné poznatky o MSP v signalizaci cytokininů a odpovědích na abiotický stres v čeledi Brassicaceae.

Abstract:

The multistep phosphorelay (MSP) mediates response to various hormonal and environmental cues, including abiotic stresses. While MSP's role in cytokinin signaling and abiotic stress response in Arabidopsis thaliana is well-documented, its role in economically important Brassicaceae crops like Brassica napus and its ancestral species B. rapa and B. oleracea remains underexplored. The first part of this study elucidates the role of type-A response regulators (RRAs), key MSP components traditionally known for negatively regulating cytokinin signaling but recently recognized for their role in abiotic stress responses. The identification of uncharacterized orthologs of RRAs showed a high conservation of protein domain structure and phylogenetic relatedness with Arabidopsis. Cytokinin treatment demonstrated a similar response kinetics to Arabidopsis RRAs. Multiple sequence alignment of the DNA-binding GARP-like domain of Brassica and A. thaliana type-B RESPONSE REGULATORS (RRBs) revealed high evolutionary conservation, suggesting similar DNA binding motifs. Analysis of cis-regulatory elements in Brassica RRA promoters and the cytokinin responsiveness of MSP reporter TCSv2:3XVENUS transformed into B. napus and B. rapa confirmed functional conservation. Additionally, Brassica RRAs displayed distinct regulatory patterns in response to cold, osmotic, and salt stresses. However, while solid evidence for transcriptional control via stress-specific transcription factors was not found, we were able to demonstrate that cytokinins contributed to cold stress-induced upregulation of RRAs in Brassicaceae. The second part of this thesis investigates natural variation in cytokinin receptor genes across Arabidopsis accessions from diverse climatic regimes to understand their cytokinin responsiveness and role in drought stress adaptation. The study explored natural variations in cytokinin-responsive histidine kinases AHK2, AHK3, and AHK4/CRE1 using the 1001 Genomes resource. Accessions with single nucleotide polymorphisms (SNPs) in these kinases showed altered cytokinin responsiveness in root-elongation assays, likely via mechanisms affecting downstream signal transduction rather than cytokinin binding. Drought stress responses analyzed with an automated plant phenotyping platform revealed that accessions with higher cytokinin sensitivity recognized drought earlier and exhibited stronger sensitivity to mild-drought conditions than Col-0. In comparison, accessions with lower sensitivity were less responsive. Introducing specific AHK4 SNP variants into cre1-2 mutant indicated these SNPs' involvement in altered cytokinin response and drought stress modulation. Overall, the results suggest a mechanism for fine-tuning stress response dynamics by altering hormonal signaling sensitivity, which could be harnessed to develop genome-edited crops with enhanced resilience to environmental stressors. By bridging the knowledge gap between model plants and economically important Brassica species, this research enhances our understanding of cytokinin signaling pathways and their roles in stress responses.

Keywords

Arabidopsis thaliana, Brassica rapa, Brassica oleracea, Brassica napus, cytokinins, multistep phosphorelay, plant hormones, type-A response regulators

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 9. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 28. 11. 2024
• Vedoucí: doc. RNDr. Jan Hejátko, Ph.D.
• Oponent: doc. Mgr. Jan Zouhar, Ph.D., Assoc. Prof. Cris Argueso, PhD, Sabine Carpin, PhD

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Vědy o živé přírodě / Vědy o živé přírodě