Funkce proteinu c-Myb ve vybraných aspektech kancerogeneze

Mgr. Lucia Knopfová, Ph.D.

Doctoral thesis

Function of the c-Myb protein in selected aspects of cancerogenesis

Abstract:

Protein c-Myb je klíčový transkripční faktor pro fyziologickou regulaci kmenových a progenitorových buněk v kostní dřeni, střevních kryptách a v neurogenních oblastech mozku. Jeho deregulace a aberantní funkce je spojena s různými typy nádorových onemocnění, včetně prsních karcinomů. Funkce proteinu c-Myb v nádorech prsu je však rozporuplná - byl klasifikován jako onkoprotein nezbytný pro mamární tumorigenezi i jako nádorový supresor. Tato práce se zabývá proteinem c-Myb v kontextu prsních karcinomů se zaměřením na jeho význam pro invazivitu a metastázování těchto nádorů. Pro studium funkce proteinu c-Myb v prsních karcinomech jsme jako modelový systém vytvořili varianty dvou buněčných linií odvozených z mamárních nádorů MDA-MB-231 a 4T1, které exprimují exogenní c-Myb (MYBup). Zkoumali jsme proliferaci, migrační a invazivní aktivitu těchto buněk in vitro, jejich tumorigenní a metastatický potenciál in vivo a vyhledávali jsme efektory proteinu c-Myb v pozorovaných procesech. Zjistili jsme, že účinek ektopické exprese c-Myb na migraci a invazivitu buněk prsních nádorů in vitro je závislý na podmínkách, konkrétně na (ne)přítomnosti chemoatraktantu a složení extracelulární matrix. Protein c-Myb stimuluje chemotaktickou migraci a invazivitu buněk prsních nádorů v Matrigelu, ale neovlivňuje chemokinetickou motilitu a penetraci kolagenu I. Ortotopicky implantované buňky 4T1MYBup tvoří v myších BALB/c pomaleji rostoucí nádory, které spontánně metastázují do kostí a jater, nikoli do plic, na rozdíl od nádorů kontrolních, které zakládají metastázy v kostech, játrech i plicích. Snížená frekvence plicních metastáz nádorů MYBup může být důsledkem omezené schopnosti cirkulujících nádorových buněk exprimujících exogenní MYB vstupovat přes cévní stěnu s kontinuální bazální membránou do plicního parenchymu. Zjistili jsme, že buňky MDA-MB-231MYBup mají ve srovnání s kontrolními buňkami sníženou schopnost transendoteliální migrace in vitro. Identifikovali jsme několik genů, jejichž exprese je deregulovaná v buňkách MYBup. Katepsin D, matrixová metaloproteináza 1 a 9 (MMP1/9) jsou spolu se signální dráhou JNK (c-Jun NH2-terminální kináza) pravděpodobně určujícími faktory zprostředkujícími účinek proteinu c-Myb na migraci a invazivitu buněk MDA-MB-231 in vitro. Myb-řízená represe Mmp1a a Msn v buňkách 4T1 by mohla být alespoň částečně příčinou selektivní inhibice plicních metastáz nádorů MYBup v myším modelu in vivo. Analýza expresních dat klinických vzorků prsních karcinomů uložených v databázích Oncomine a GEO naznačila relevanci pozorované inhibice MMP1/MSN proteinem c-Myb pro prognózu a metastázování karcinomů prsu onkologických pacientek. Výsledky této práce přispívají k poznání funkce proteinu c-Myb v biologii prsních karcinomů, nabízejí nový pohled na jeho rozporuplné působení jako onkoproteinu/nádorového supresoru v těchto nádorech a představují c-Myb jako protein, jehož funkce podléhá regulaci kontextem mikroprostředí s důsledky pro matrix-dependentní invazivitu, extravazaci a organotropismus buněk prsních karcinomů.

Abstract:

The c-Myb transcription factor is essential for the maintenance of stem-progenitor cells in bone marrow, colon epithelia, and neurogenic niches. c-Myb malfunction contributes to several types of malignancies including breast cancer. However, the function of c-Myb in the mammary tumorigenesis and progression of breast carcinomas is controversial, as both oncogenic and tumor suppressive effects of c-Myb have been reported. The aim of this study is to clarify the role of c-Myb in invasion and metastatic spread of breast tumor cells. To gain insight into this process, we generated variants of mammary carcinoma cell lines MDA-MB-231 and 4T1 overexpressing MYB (MYBup cells). We investigated their proliferation rates, migratory/invasive activity in vitro and tumorigenic and metastatic capabilities in vivo. In addition, we intended to identify molecular targets of the c-Myb protein mediating its effects. We observed that MYB overexpression affected cell migration and invasion in vitro in a context-dependent manner, depending on the presence of chemoatractant or composition of matrix. c-Myb promoted chemotactic migration and invasion through Matrigel-coated membrane, but affected neither the motility in the chemokinetic setting neither kolagen I gel penetration. Surprisingly, the growth of tumors resulting from injection of Myb-overexpressing 4T1 cells into the mammary fat pads of BALB/c mice was delayed and formation of spontaneous pulmonary metastases did not occur, though formation of the bone and liver metastases was not affected. The selective disadvantage of these cells in lung colonization might result from their inability to penetrate a vessel wall and underlying basement membrane in lung parenchyma. We demonstrated that capacity of transendothelial migration of MDA-MB-231MYBup cells was impaired. We identified several genes with deregulated expression in MYBup cells, including CTSD, MMP1 and MMP9. The proteins coded by these genes (cathepsin D, matrix metalloproteinase 1 and 9) together with components of JNK (c-Jun NH2-terminal kinase) signaling pathway may represent the key determinants of the Myb-induced effects on cell migration and invasion in vitro. On the other hand, the Myb-driven suppression of Mmp1a and Msn expression in 4T1 cells may explain the failure of the Myb-overexpressing tumors in lung colonization. The expression profiles of human breast carcinoma specimens deposited in Oncomine and GEO databases indicate that the Myb-mediated repression of MMP1/MSN might be of clinical relevance for breast carcinoma patients. Results of this study provided new insight into the c-Myb function in breast cancerogenesis and brought new clues to understand its controversial status as an oncogene/tumor suppressor in breast cancer. In addition, the conclusions offer a new concept of the microenvironment-dependent function of c-Myb represented by matrix-specific invasion, extravasation and site-selective metastases of breast carcinomas.

Keywords

c-Myb, prsní karcinom, migrace, invazivita, metastáza, extravazace, matrixová metaloproteináza, katepsin D, extracelulární matrix, breast cancer, migration, invasion, metastasis, extravasation, matrix metalloproteinase, cathepsin D, extracellular matrix

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 28. 1. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 1. 3. 2013
• Supervisor: prof. RNDr. Jan Šmarda, CSc.
• Reader: Mgr. Stjepan Uldrijan, CSc., Mgr. Jan Bouchal, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology