Kombinace separačních metod s hmotnostní spektrometrií pro charakterizaci sacharidů

Bc. Ivo Fabrik

Diplomová práce

Characterization of carbohydrates using combination of separation techniques and mass spectrometry

Anotace:

Detailní analýza sacharidů v reálných vzorcích je z hlediska jejich strukturní podobnosti velmi náročným úkolem. Jedním z přístupů k řešení tohoto problému je zjednodušení směsi vhodnou separační metodou s následnými MSn experimenty. Pro usnadnění ionizace a zvýšení odezvy se při hmotnostně spektrometrické analýze sacharidů často využívá přídavků solí. Tento přístup byl zvolen pro analýzu sacharidů přítomných v různých stádiích výroby piva (ječmen, slad, sladina, povařená a prokvašená mladina). Na základě výsledků z MALDI-TOF MS analýzy sacharidů a proteinů byla pro eliminaci enzymatické aktivity u vzorků ječmene a sladu vybrána extrakce 80% ethanolem (55 °C). Pro separaci a kvantifikaci sacharidů přítomných ve vzorcích bylo využito aminokolony v HILIC módu HPLC s izokratickou elucí a refraktometrickou detekcí (mobilní fáze 60% a 65% acetonitril). Kromě sacharosy a rafinosy byly ostatní sacharidy v extraktu ječmene pod limitem detekce. Extrakt sladu obsahoval oligosacharidy sacharosu, rafinosu a maltosu. Ve vzorcích sladiny, povařené a prokvašené mladiny byly kvantifikovány maltooligosacharidy s DP 2─7. Extrakty ječmene, sladu a vzorky sladiny, povařené a prokvašené mladiny byly pomocí HPLC rozděleny a sesbírané frakce analyzovány pomocí off-line MSn experimentů provedených na ESI-IT. Na základě srovnání fragmentačního chování sacharidů v kladném a záporném módu byl jako aditivum frakcí zvolen NH4H2PO4. Citlivost MS detekce se tak zvýšila o více než dva řády, relativní intenzita cross-ring fragmentů také narostla. V MS2 spektrech maltooligosacharidů byly pozorovány fragmenty vzniklé z prekurzorů [M─H]- a [M+H2PO4]-. Pro identifikaci neredukujících sacharidů bylo využito MS3 experimentů. V extraktu ječmene byla takto kromě výše zmíněných sacharidů detekována nystosa, v extraktu sladu maltotriosa, maltotetraosa, dále stachyosa a verbaskosa. Ve frakcích sladiny byla potvrzena přítomnost maltooligosacharidů do DP 9 a oligosacharidů rafinosové řady do DP 8. V povařené a prokvašené mladině bylo dosaženo obdobných výsledků. HPLC separace s následnou off-line detekcí po přídavku NH4H2PO4 pomocí MS a MSn experimentů poskytuje účinný nástroj pro strukturní analýzu oligosacharidů přítomných v reálných vzorcích.

Abstract:

From the structural point of view the detailed carbohydrate analysis of real samples is very difficult task. To solve this problem, reducing of complexity of their mixture by appropriate separation technique followed by MSn experiments may be done. An improvement in ionization and response of carbohydrates in MS could be carried out using the additions of appropriate salts. This approach was chosen for specific carbohydrate analysis in the technological stages of beer production (barley, malt, sweet wort, wort, and green beer). On the basis of MALDI-TOF MS results for saccharides and proteins, 80% ethanol (55 °C) was chosen as a solvent for the extraction step of barley and malt samples. HPLC in HILIC mode with isocratic elution and refractometric detection was used for the separation and quantification of saccharides present in the samples (60% and 65% acetonitrile as a mobile phase). In the barley extract, sucrose and raffinose dominated. Other saccharides were not detected. Sucrose, raffinose, and maltose were determined in the malt extract and analogously maltooligosaccharides of DP 2─7 in the samples of sweet wort, wort, and green beer. Fractions collected after HPLC separation of barley and malt extracts and brewing samples were analyzed by off-line MSn experiments on an ESI-IT instrument. On the basis of fragmentation behavior of saccharides in positive and negative ion modes of mass spectrometry, NH4H2PO4 was chosen for an addition to fractions. Salt increased detection sensitivity by more than two orders of magnitude together with enhancement in relative intensities of cross-ring fragments. Fragments resulting from precursors [M─H]- and [M+H2PO4]- were present in MS2 spectra of maltooligosaccharides, non-reducing saccharides could be distinguished by MS3 experiments. In addition to above-mentioned saccharides, nystose in barley extract was detected, and, similarly, maltotriose, maltotetraose, stachyose and verbascose were detected in malt extract. Presence of maltooligosaccharides (up to DP 9) and raffinose family oligosaccharides (up to DP 8) was confirmed in the fractions of sweet wort and the other brewering samples. HPLC separation followed by an addition of NH4H2PO4 and off-line detection by MS and MSn experiments is an efficient technique combination that can elucidate a structure of oligosaccharides present in real samples.

Klíčová slova

oligosacharidy, extrakce, HPLC, tandemová hmotnostní spektrometrie, strukturní analýza, sladování, pivovarství, oligosaccharides, extraction, tandem mass spectrometry, structural analysis, malting, brewing

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 30. 4. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 10. 6. 2010
• Vedoucí: Mgr. Richard Čmelík, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie